Грузоперевозки крупные: Грузоперевозки Большие Аты | Рассчитать стоимость доставки груза

Перевозка больших партий груза | Транспортно-логистическая компания ЭйрТрансс

На сегодняшний день транспортная компания ООО «ЭйрТрансс» является — мультимодальным транспортным оператором, что в свою очередь позволяет успешно конкурировать на транспортно — логистическом рынке РФ.

В спектр предоставляемых услуг входит перевозка  партий груза любой тоннажности и объема, как наземным, воздушным так и водным транспортом.

Гибкость ценовой политики компании и ориентированность на клиента позволяет доставлять груз в кратчайшие сроки, при этом оставаясь в разумном тарифном плане.

Калькулятор

Кроме того компания ЭйрТрансс имеет уникальную возможность: предоставления своим клиентам всего спектра услуг складской логистики, что дает дополнительную возможность консолидации груза в логистических центрах компании для дальнейшей доставки товара к конечному потребителю. Наши постоянные партнеры – крупнейшие производители различных товаров, промышленные предприятия и оптовые фирмы.

Ведь сотрудничество с таким проверенным и надежным грузоперевозчиком, как наша компания, гарантирует своевременную доставку груза заказчику. ЭйрТрансс доставляет любые грузы (независимо от их объема) точно в срок.

Мы перевозим:

• Оптовые партии одежды и обуви,
• Бытовую технику,
• Промышленное оборудование,
• Оргтехнику и комплектующие,
• Автозапчасти,
• Стройматериалы,
• Продукты питания и др.

На протяжении нескольких десятков лет самым популярным видом транспорта для перевозки крупных партий является большегрузный автомобиль с прицепом. Транспортировка груза происходит на одной или 2-3 фурах одновременно. Мы забираем груз прямо со склада отправителя и доставляем в пункт назначения «до двери». Целесообразность использования автотранспорта, безусловно, заключена в его мобильности. Там, где нет железнодорожных линий и аэропорта, доставка грузов на фурах просто незаменима.

Мы уделяем огромное внимание распределению груза внутри автомобиля. Многотонные грузы состоят, как правило, из множества частей, упакованных в короба или специальные тары. Чтобы груз не был поврежден в пути, сотрудниками ООО «ЭйрТрансс» оперативно составляется схема укладки груза. Так, в случае с бытовой техникой, нижний ряд займут такие приборы, как холодильники, плиты, сплит-системы; в верхнему ряду окажется более хрупкая техника – жк-мониторы, телевизоры, небольшие технические приборы для кухни (соковыжималки, кухонные комбайны, кофеварки и др.). Также мы используем специальные крепления (распорные рамки, крепежные цепи, ограничительные щиты), надежно фиксирующие груз внутри автомобиля.

Мы оформляем все необходимые сопутствующие документы, страхуем груз и решаем вопросы таможенного контроля в случае транспортировки товаров в ближнее зарубежье. Вы можете также воспользоваться услугами наших опытных экспедиторов, сопровождающих груз на протяжении всего пути следования.

По желанию клиента перевозка особо ценных грузов производиться под усиленной охраной. А чтобы не испытывать лишних волнений, можно самостоятельно следить за движением груза в системе он-лайн или посредством звонка менеджеру нашей компании. Тарифы на автомобильные перевозки крупных партий груза зависят от количества используемых машин и удаленности конечного пункта. Высококвалифицированными водителями ООО «ЭйрТрансс» изучены практически все автомобильные маршруты России: от Калининграда  до Южно-Сахалинска и от Владикавказа до Мурманска.

Неоспоримым преимуществом по скорости при перевозке грузов на дальние расстояния пользуется грузовой самолет. Если вы нуждаетесь в оперативной доставке груза, всегда в вашем распоряжении услуга авиаперевозок от ООО «ЭйрТрансс». Собственные подразделения в крупнейших городах России делают перевозку грузов самолетом максимально удобной. Доставка грузов до аэропорта , а также такелажные работы – полностью наша задача.

Для автомобильных концернов, предприятий по производству стройматериалов, различных жидкостей, поставщиков промышленного оборудования приоритетными являются железнодорожные перевозки. Грузы, транспортируемые в закрытом контейнере, загружаются прямо на складе отправителя и посредством автомобилей ООО «ЭйрТрансс» доставляются на станцию. Если необходимо использовать открытые полувагоны или платформы, мы доставляем груз на железную дорогу и организуем такелажные работы. Несмотря на то, что перевозка грузов по ж/д занимает значительно больше времени, чем на самолете или фуре, она не зависит от погодных условий. Заключив с нашей компанией договор о регулярных грузоперевозках по железной дороге, вы можете быть уверены в том, что отправка грузов будет производиться по указанному графику.

Еще одна транспортная мощность, которой располагает ООО «ЭйрТрансс» — речные суда, курсирующие по Енисею от Красноярска до Дудинки в период навигации. Грузовое судно способно поднять на борт многотонные партии различных грузов: от товаров народного потребления до металлоконструкций. Для скоропортящихся продуктов предусмотрены контейнеры-рефрижераторы. Речные грузоперевозки – наиболее выгодный вариант в Красноярском крае. Ведь данное направление охватывает три важных порта: Красноярск, Игарка, Дудинка. А при необходимости груз может быть доставлен в Норильск, на склад нашей компании или «до двери» заказчика.

Если пункт назначения находится в одном из городов, где расположены филиалы ООО «ЭйрТрансс», наши партнеры могут воспользоваться услугой ответственного хранения груза на современном, технически оборудованном складе. Москва, Санкт-Петербург, Сочи, Новосибирск, Красноярск – в этих крупнейших городах России компания имеет собственные складские помещения. Выполнив транспортировку многотонного груза на наш склад, вы сможете постепенно осуществлять доставку груза заказчикам небольшими партиями. На нашем складе есть специализированные залы для хранения особо ценных грузов и продуктов питания (по согласованию). Благодаря системам климат-контроля в отдельных частях склада может быть установлена необходимая температура для хранения тех или иных товаров. По вашему желанию сотрудниками ООО «ЭйрТрансс» будет проведена полная либо частичная инвентаризация груза.

Также территория нашего склада нередко используется и для кросс-докинга. Заказчики, которым привезен груз, могут приехать на собственных грузовых машинах и прямо с фур перевозчика принять груз. Сквозное складирование пользуется огромной популярностью среди тех компаний, в ведении которых находятся скоропортящиеся грузы.

Грузоперевозки на самых выгодных условиях – важнейшая задача компании ЭйрТрансс. Мы ежедневно работаем над тем, чтобы нашим клиентам было как можно проще осуществлять транспортировку больших партий груза в любые города России и других стран.

Грузоперевозки — Большие Вяземы | Цены на услуги перевозки груза заказать на сайте частных объявлений Perevozka24

27.12.2021 №732873

16000 на карту при разгрузке. Груз: Медицинское оборудование

09.10.2021 №705729

Груз представляет собой офисную мебель и кресла. Общий вес = 14500 кг., объем = 95 м3 Адрес загрузки — Московская область, Одинцовский район, Большие Вяземы, городок 17 стр.9 Дата загрузки — 11.10.21 (понедельник) Адрес выгрузки — г. Новороссийск, Сухумское шоссе, 73А Дата выгрузки — 13.10.21 (среда) Требуемый вид автотранспорта — сцепка 110-120 м3 !!! Оплата — только безнал с НДС или без НДС.

08. 10.2021 №705223

Груз — офисная мебель, офисные кресла, вес = 15 тонн, объем = 100 м3 Адрес загрузки — Московская область, Большие Вяземы, городок 17 стр.9 (контактное лицо Евгений +7 926 855-3456) Дата загрузки — 08.10.21 (пятница) Адрес выгрузки — г. Новороссийск, Сухумское шоссе, 73А (контакное лицо будет указано позже) Дата выгрузки — 12.10.21 (вторник) Авто — только сцепка (110-120 м3) !!! Оплата — только безнал (с НДС или без НДС).

07.10.2021 №704854

2 кресла, минибар, жур. столик, эл. камин.

28.09.2021 №700567

Доставка догрузом. Груз на складе. Груз представляет собой журнальные столики на 1 паллете: 120*80*40, весом 120 кг. Адрес загрузки — Одинцовский район, Большие Вяземы, городок 17 стр 9 (контакт Евгений) Адрес выгрузки — Тобольск, промзона (контактное лицо будет указано позднее) Дата доставки груза на объект — не позднее 04/10/21 Оплата по безналу с НДС или без НДС.

13. 08.2021 №676351

Мраморная плитка

25.06.2021 №650021

Груз представляет собой мебель (диваны, кресла), вес груза 2,5 т., объем — 55 м3. Ищем станадртный тент. Оплата по безналу с НДС или без НДС после выполнения заказа по договору с юрлицом.

15. 06.2021 №644244

Груз представляет собой кресла и диваны общим весом около 2,5 тонн, обеъемом 55 кубов. Адрес загрузки — Моск. область, Одинцовский район, Большие Вяземы, городок 17 стр.9 Дата загрузки: 16.06.21 с 15ч. Адрес доставки: г. Иркутстк, ул. Леси Ураинки, 35 Стоимость доставки — 220 т.р., оплата по безналу только на юрлицо, желательно с НДС. Оплата 5 дней с момента выгрузки товара клиенту.

04.06.2021 №639239

Нужно перевезти груз, гранитные ступени вес 1240 кг

07. 10.2020 №567706

Необходимо доставить одно кресло в разборном виде догрузом: Адрес забора: Московская область, Одинцовский район, Большие Вяземы, городок 17 стр.9 Дата забора: 07.10.20 с 18ч. Адрес доставки: г. Тюмень, ул. Бориса Житкова, 4 Дата доставки: крайне желательно 09.10.20 Оплата на карту Сбербанка или начичными на выгрузке (10 т.р.)

22.08.2020 №544945

Нужна машина. Квартирный переезд. Мебель, холодильник, стиральная машина, и т. д.

14.05.2020 №486839

Нужно перевезти профлист. 5 тонн, ширина 1.25 м. Длина 3 м. Высота 0.3 м. Загрузка верхняя.

26.03.2020 №472647

Радиаторы отопления примерно 700-800 кг

25. 09.2018 №271799

Здравствуйте! нужен «фургон» (газель или что-то подобное) для перевозки груза из СПБ в Сланцы. Везем мебель. Забор груза с Энгельса 93, потом догрузка на Кожевенной линии 34, потом на Черниговской 35 и дальше едем на выгрузку в Сланцы. Интересует цена за данную работу

Стоимость рекламы

Транспортная компания ВЛ Лоджистик в Уссурийске

Уссурийск – один из крупных городов в Приморском крае. Транспортная компания ВЛ Лоджистик доставляет грузы из/в Уссурийск вот уже более 20 лет. Сейчас компания имеет обширную сеть представительств по всей России, и одним из первых был открыт филиал в городе Уссурийск.

Логистическая компания ВЛ Лоджистик – одна из крупнейших транспортных компаний Приморского края и всего Дальнего Востока. Компания начала свою деятельность в Приморье, и ее специалисты, как никто другой, разбираются во всех аспектах и тонкостях логистики региона.

Своим клиентам мы рады предложить весь комплекс логистических услуг: доставка груза “до двери” или складского терминала, услуги склада, таможенное оформление международных грузов.

Осуществляем ЖД перевозки грузов вагонами и контейнерные перевозки, морские перевозки, доставляем сборные грузы автотранспортом и по железной дороге, организуем доставку грузов машинорейсами по всей России. Предлагаем международные перевозки из стран Азии, Европы, Америки и любой точки мира с последующим таможенным оформлением (ВЛ Лоджистик – официальный таможенный брокер).

Беремся за сложные перевозки: негабарит, перевозки рефрижераторами, опасные грузы. Мы профессионалы с огромным опытом, вы можете доверить нам свой груз.

В зависимости от выставляемых клиентом требований к перевозке подбираем наилучший маршрут и способ транспортировки. Имея в собственности более 3000 контейнеров, сотни единиц грузового автотранспорта, а также собственные запатентованные наработки по доставке различных типов груза, мы экономим деньги наших клиентов.

Дополнительные услуги: обрешетка груза, страхование, отслеживание груза и консультация клиента на всем пути следования. Также на базе складских комплексов предоставляем услуги: переупаковка, маркировка, комплектование мелких и крупных отправок.

Транспортная компания ВЛ Лоджистик – ваш надежный партнер в сфере транспорта и логистики.

Грузоперевозки в Германию

№

Город назначения

Километраж, км

Время в пути*

Компании-перевозчики обладают всеми теоретическими современными знаниями, согласно международных таможенных правил перевозок грузов, практическим опытом. Провоз грузов осуществляется через несколько стран, соответственно прохождением процедур через несколько таможенных контрольных пунктов.

Эти перевозки не считаются простыми. Так, например, грузоперевозки Москва–Германия проходят первоначально через Петербургскую таможню. Она отличается более щадящим режимом проверки. Таможенные брокеры ведущих российских компаний тщательно проводят процедуры сертификации, очистки грузов и разрешению любых непредвиденных вопросов, возникающих во время прохождения груза через таможенный пост. В этой таможне большинство импортеров по доставке грузов Германии имеют многолетний опыт работы и положительную репутацию.

Если Вы еще не являетесь клиентом нашей компании, мы рекомендуем Вам заполнить заявку на сайте. Правильно оформленная заявка может иметь силу договора, поэтому нашим клиентам даже не нужно посещать офис компании для уточнения условий перевозки. В случае если у вас вопросы, звоните нам по контактным телефонам, чтобы грузоперевозки Германия-Россия-Германия были оформлены в соответствии с Вашими требованиями.

Задать вопрос и сделать
заказ можно по телефону:

+7 (495) 755-39-61

Цены на грузоперевозки в Германию уточните по многоканальному круглосуточному телефону +7-495-150-29-39 или оставьте заявку на нашем сайте.

Вес, т	До 2	До 4	До 6	До 10
Объем, м3.	10-14	18-24	26-37	40-55
Размеры, м	4,2*2,0м	6,2*2,4м	7,5*2,25м	13,6*2,8м

Карта маршрута

Протяженность маршрута Москва — Германия составляет 2135 км. Время в пути 21 ч. 43 мин.

Доставка грузов в Германию

История торговых отношений Германии с Россией уходит в глубину веков. Современная торговля между странами гораздо насыщенней, динамичнее в сравнении с предыдущими временами. Огромная доля в функциональной динамичности развития отношений принадлежит логистической системе, в частности транспортным грузоперевозкам. Как известно, территория Германии является центром для торговых потоков стран Америки, Европы, Азии. Поэтому грузоперевозки из Германии – это основное звено деятельности российских бизнесменов.

Грузоперевозки осуществляются по распределению:

• контейнерные грузы;
• негабаритные грузы;
• сборные грузы;
• мелкие грузы;
• крупные.

Крупные компании-перевозчики заботятся о своих клиентах и предоставляют ускоренный темп оформления с первоначальным алгоритмом, а именно: подача заявки на перевоз грузов проходит через электронные варианты, а также информация о грузе, и др. документы. Перевозка грузов в Германию зависит от выбора компании-подрядчика, и заказчик должен знать несколько основных моментов:

• наличие доступа у компании к автомобилям грузовым с катализатором euro3. Так как это требования правил перевозок государств Евросоюза;
• наличие штата водителей-экспедиторов с практическим опытом прохождения таможенных пунктов стран;
• обязательно постоянная круглосуточная связь с экспедитором груза для уведомления различных нюансов и конечного прибытия в пункты назначения груза.

Отправка груза в Германию происходит ежедневно крупными партиями. Поэтому этот процесс отличается слаженностью и надежностью для малых, средних и крупных бизнесменов и предприятий России.

Специалисты

Семен Сергеевич МВЛ и ВВЛ

Специалист по авиационным перевозкам

+7 (495) 150-29-39

broker@fortunalog. ru

Семён Сергеевич (МВЛ и ВВЛ)

Специалист по авиационным перевозкам

+7 (495) 150-29-39

[email protected]

Семён Сергеевич

Специалист по контейнерным перевозкам

+7 (495) 150-29-39

[email protected]

Семён Сергеевич

Специалист по автоперевозкам (Европа, СНГ и Россия)

+7-495-150-29-39

broker@fortunalog. ru

Сколько стоят грузоперевозки в современных условиях

В крупных российских центрах и в небольших городах сегодня функционируют тысячи транспортных компаний. Они различаются как по качеству и ассортименту предоставляемых услуг, так и по их конечной стоимости для потребителя.

При выборе агентства по доставке именно цена транспортировки часто является определяющим фактором. Но стоит ли ориентироваться только лишь на низкую стоимость оказываемых услуг? Конечно же нет, и многолетний опыт нашей деятельности в этом сегменте рынка это подтверждает. Ведь в современных условиях, когда нарушена единая транспортная инфраструктура страны, стоит доверять только тем перевозчикам, которые могут гарантировать быструю доставку и полную сохранность грузов.

Мелким фирмам это, в большинстве случаев, оказывается не под силу, и потому их деятельность обычно ограничивается лишь одним городом или областью. Наша компания, имея богатый опыт работы по транспортировке грузов, осуществляет доставки по всей территории страны, а при желании заказчика – и за ее пределы.

Нами детально разработаны оптимальные логистические маршруты и созданы все условия для доставки грузов любой категории сложности. Следует учитывать, что итоговая стоимость складывается из многих факторов, определяющих качество выполненных услуг. В своей деятельности мы используем только новейшую транспортную технику от самых известных мировых производителей. Все автомобили нашей компании оснащены средствами спутниковой GPS-навигации, что позволяет детально отслеживать маршрут передвижения. Внедрение этой системы слежения позволяет осуществлять функции контроля за движением транспорта и точно выполнять сроки доставки.

В процессе транспортировки учитывается так же ценность и сложность груза, для чего применяются специальные средства доставки. Специфика груза так же влияет на конечную стоимость транспортных услуг, и при этом Вы можете быть спокойны за полную сохранность грузов в процессе перевозки.

В случае необходимости автомобили оснащаются дополнительными средствами защиты, обеспечивающими безопасность перевозки. В процессе транспортировки, благодаря системе спутникового слежения, мы можем представлять заказчикам подробные отчеты о ходе доставки грузов.

 

К списку статей по грузоперевозкам

Транспортная компания — автомобильные и железнодорожные грузоперевозки

ООО «НЕТВОРК ЛОГИСТИК» создано в 2013 году на базе Департамента наземных перевозок крупнейшего в России  авиаэкспедитора —

Цель — реализация крупных проектов по наземной доставке для крупных западных компаний: KUEHNE+NAGEL, Volkswagen Group Rus и многих других. Общий опыт работы команды НЕТВОРК ЛОГИСТИК на рынке — более 9 лет. За это время мы выросли из небольшого экспедиторского департамента в транспортно-логистическую компанию федерального уровня с сотней машин, десятком филиалов и несколькими сотнями сотрудников.

Мы специализируемся на доставке по РФ сборных грузов и доставке полными машинами: АВТО, ЖД и АВИА.  

Наши преимущества:

• Индивидуальный подход. В каждом процессе.

• За каждым клиентом закрепляем профессионального клиентского менеджера, который в режиме 24/7 решит любые вопросы с доставкой;
• Возврат оригиналов документов за 20 дней, с оплатой счетов по оригиналам;
• Гибко подстроимся под ваши графики и сроки;
• Готовы к существенным отсрочкам платежа для крупных проектов;
• Сформируем индивидуальный тариф в вашем формате согласно RFQ;
• Надежность и профессионализм.
•     Компания существует с 2013 года
•     Собственный парк более 70 транспортных средств различной грузоподъемности, 
•     12 филиалов и 68 агентов в регионах РФ
•     Мы — основной наземный перевозчик компаний Renault, Nissan, VOLKSWAGEN, FORD, Schneider Electric, GEOX, Benetton
•     KPI доставка в срок – 98,5%.

• Мы отправляем грузы из Москвы в день приема к перевозке.  
• Машины на регионы выходят ежедневно, строго по графику.
  
• Кротчайшие маршруты с минимальным транзитным временем
• Все машины прибывают на региональный склад утром. Грузы готовы к выдаче или доставке утром в день прибытия.

Скачайте презентацию о НЕТВОРК ЛОГИСТИК

Перевозка грузов ж/д транспортом из Москвы по всей России

Ж/д перевозки

Ж/д перевозки грузов сегодня зарекомендовали себя как самый быстрый, безопасный и недорогой способ отправить багаж из Москвы в любой регион России. Железнодорожный транспорт – это прежде всего надежность и четкое выполнение сроков, поэтому если вы решили заказать доставку багажа из Москвы, рекомендуем вам осуществить это с помощью ж/д перевозки.

Транспортная компания «Азимут» осуществляет ж/д отправку груза в багажных вагонах скорых пассажирских поездов. С нами вы можете отправить в другой город совершенно любой багаж – важно лишь, чтобы они проходили в двери вагона. Кроме того, наша компания разработала несколько полезных дополнительных опций, использование которых значительно облегчит перевозку груза ж/д транспортом для любого клиента.

Кому полезна услуга доставки груза по железной дороге

Заказывать транспортировку багажа выгодно:

• крупным производственным компаниям;
• промышленным предприятиям;
• строительным организациям;
• юридическим лицам;
• физическим лицам.

Деятельность компании «Азимут» ориентирована на любых клиентов, будь то крупные корпорации или физические лица. Мы принимаемся за отправку любых грузов: каждый, кто к нам обратился, получит свои, самые выгодные условия перевозки. Так, клиенты, отправляющие багаж целыми вагонами, получают ощутимые скидки на доставку, и их груз отправится в другой город России сразу в день погрузки. А клиенты, отправляющие небольшие посылки, могут воспользоваться доставкой сборного груза.

Ключевые преимущества доставки ж/д транспортом

Среди перечисленных выше качеств в пользу ж/д грузоперевозок можно выделить следующие:

• быстрая доставка в любой регион России;
• возможность регулярных перевозок;
• доставка в любые погодные условия;
• индивидуальный подход к каждому;
• выгодные тарифы на ж/д грузоперевозку.

Мы бережно относимся к любому вверенному грузу, что позволяет нам доставлять 100% багажа в целости и сохранности. В пути ваш багаж находится под наблюдением сотрудников компании «Азимут», благодаря чему любой доставляемый багаж будет вручен получателю.

Почему именно «Азимут»?

Наша компания имеет многолетний опыт работы в сфере логистики. Мы транспортируем самые разные грузы по России уже более 12-ти лет. Мы постоянно работаем над расширением географии «Азимут», и открываем все новые филиалы, чтобы доставка ж/д транспортом была для вас еще комфортнее. Закажите перевозку багажа прямо сейчас, оставьте заявку на нашем сайте!

Канада Грузоперевозки и грузоперевозки — Big Freight Systems Inc.

Эксперты в области управления грузовыми перевозками и транспортом в Северной Америке и за рубежом  

Big Freight Systems — ведущая канадская компания, занимающаяся грузовыми перевозками и управлением грузоперевозками, с 70-летним опытом предоставления решений для цепочек поставок. Мы являемся инновационным сервисным партнером, приверженным профессиональной и своевременной доставке грузов. Независимо от того, используете ли вы наш собственный автопарк или грузовики или автомобили наших перевозчиков, нанятых по контракту, наши специалисты гарантируют, что ваша продукция будет быстро перемещена и безопасно доставлена ​​из пункта отправления в конечный пункт назначения.

В Big Freight используется только ведущее в отрасли оборудование, а за рулем сидят только лучшие водители. Наш девиз говорит само за себя — Better Drivers… Better Service®

ОДНА КОМПАНИЯ, ЧЕТЫРЕ СПЕЦИАЛЬНОСТИ …

Управление грузоперевозками на основе активов

Наши профессиональные специалисты по транспортировке используют парк Big Freight из 600 единиц подвижного состава для оптимизации и управления транспортировкой, отслеживанием и складированием вашего груза.Будь то канадские или международные перевозки, у нас есть лучшие решения для цепочки поставок.

Группа логистики

Наша команда логистики предлагает внутреннюю систему, которая сочетает в себе наши услуги по перевозке грузов, управление информацией и партнерских перевозчиков, чтобы максимизировать ценность и возможности для вас. За прошедшие годы Big Freight разработала комплексную программу партнерских перевозчиков, которая укрепляет нашу способность выполнять задачи вашей цепочки поставок экономичным и эффективным образом, позволяя вам сосредоточиться на своем основном бизнесе.

Техническое обслуживание флота

Big Freight предоставляет услуги по профилактическому техническому обслуживанию и ремонту грузовиков и прицепов через свой объект FleetPro, расположенный в Штайнбахе, Манитоба, Канада. В дополнение к ремонту коммерческих грузовиков и прицепов, FleetPro предлагает профессиональные услуги по управлению автопарком, которые можно настроить в соответствии с потребностями вашей компании. Работая семь дней в неделю, сертифицированные механики FleetPro всегда рядом, когда они вам нужны.

Складское хозяйство

Складские помещения Big Freight расположены в Виннипеге, Манитоба, Канада, и могут предложить варианты краткосрочного и долгосрочного хранения.Наши складские решения также включают в себя отслеживание ваших запасов с помощью современного программного обеспечения для управления запасами и предоставление настраиваемых отчетов по ключевым показателям эффективности. С Big Freight Warehousing вы всегда будете знать, что у вас есть на складе.

Сертификаты для крупных грузов

Как одна из старейших транспортных компаний Манитобы, Big Freight предлагает то, что вам нужно… отмеченные наградами решения, лучшие водители, оборудование и технологии!

 

Наши аффилированные компании

      

Грузовые перевозки: виды транспорта

Существует три основных вида транспорта, которые следует учитывать при организации логистики грузовых перевозок: наземный — включая полные грузовики (FTL) и частично загруженные грузовики (LTL), — воздушный и морской. Но когда вы начинаете сравнивать такие параметры, как скорость доставки, цены и охват между этими различными режимами, может быть трудно понять, какой из них лучше всего подходит для вашего бизнеса.

Нужна доставка на следующий день? Транспортировка воздушным или наземным транспортом является отличным вариантом. Вам нужно перевезти груз по всему миру без больших затрат? Доставка морем – проверенный временем способ. Но сравнение каждого вида транспорта может быть сложным, поэтому мы вас обеспечим. Загрузите нашу инфографику, которая поможет вам решить, какой вид транспорта лучше всего подходит для ваших грузовых перевозок.

Когда вы начнете ориентироваться в этих режимах доставки грузов, важно учитывать, чем они отличаются. Хотя каждый метод доставляет ваши грузы из точки А в точку Б, одно решение может работать для вашего бизнеса лучше, чем другое:

• Авиа: Как вы узнаете из нашей инфографики, авиаперевозки являются одним из самых быстрых способов доставки; идеально подходит для скоропортящихся и срочно отправленных товаров. Это также один из самых быстрых способов доставки вашего груза по всему миру.
• Океан: Хотя и не так быстро, грузы доставлялись морем на протяжении веков. Все виды крупногабаритных грузов, загруженные в металлические контейнеры, отправляются по всему миру морским транспортом — это отличный и экономичный вариант, если вы не спешите.
• Основание: Грузовые автомобильные перевозки, в том числе как полноценные, так и сборные, — это давно проверенный способ перевозки грузов в США, Канаде и Мексике. Доставка FTL идеально подходит для доставки хрупких или ценных предметов, в то время как LTL отлично подходит для более прочных грузов, которые могут потребовать дополнительной обработки в пути.

Каждый способ транспортировки приносит что-то свое на стол и в ваш бизнес. Загрузите нашу инфографику , чтобы узнать о различиях между вашими вариантами доставки грузов и выяснить, какой метод подходит именно вам.

Молекулярные детерминанты транспорта крупных грузов в ядро ​​

[Примечание редактора: авторы повторно представили на рассмотрение исправленную версию статьи. Далее следует ответ авторов на первый раунд рецензирования.]

Сводка основных изменений:

Мы благодарим обоих рецензентов за отзывы о нашей работе. Следуя всем предложениям рецензентов, мы существенно переработали рукопись и расширили некоторые пункты новыми вспомогательными данными (как экспериментальными, так и теоретическими). Ниже мы резюмируем основные аспекты, прежде чем углубляться в более конкретное пошаговое обсуждение комментариев отдельных рецензентов:

1) Мы полностью изменили способ анализа данных, сосредоточившись на более надежном анализе измеренных кинетических параметров (полностью пересмотренный рисунок 5, а также дополнительный файл 2 и дополнительный файл 3).Этот анализ был выполнен в новом сотрудничестве с теоретической группой доктора Антона Зильмана из Университета Торонто. Теперь мы представляем минимальную биофизическую модель транспортировки крупных грузов через NPC, которая включает в себя только наиболее характерные особенности энергетики и кинетики транспорта. Модель очень хорошо описывает наши экспериментальные данные и позволяет нам сделать вывод об основных детерминантах транспорта капсида с точки зрения их размера и количества NLS. Мы в долгу перед рецензентами за то, что они побудили нас искать более глубокую интерпретацию наших данных, что привело к значительно улучшенной статье, которая теперь представляет собой хорошо сбалансированное сочетание эксперимента и теории.

2) Мы сотрудничали с группой доктора Питера Ленарта из MPI для биофизической химии Геттингена, чтобы провести эксперименты по инъекции в живые ооциты морской звезды (новый рисунок 2 — дополнение к рисунку 2). Все результаты качественно согласовывались с данными наших пермеабилизированных ячеек. Кроме того, мы хотим отметить достоинства работы с пермеабилизированными клетками, которые становятся очевидными при совместном рассмотрении обоих экспериментов: это позволяет нам поместить наши результаты в гораздо более широкий контекст доступной литературы, поскольку это все еще наиболее часто сообщаемый транспортный анализ. Примечательно, что анализ пермеабилизированных клеток также обеспечил лучший доступ к количественному определению биофизических параметров.

3) Кроме того, мы подкрепляем наше предыдущее обсуждение роли поверхностных зарядов капсидов новыми прямыми экспериментальными данными с использованием капсидов с модифицированными поверхностными зарядами (пересмотренный рисунок 5C).

Рецензент №1:

По сравнению с ядерными транспортными грузами типичного/среднего размера данных о скорости транспортировки крупных грузов комплексами ядерных пор (ЯПК) мало.Авторы исследовали пригодность и скорость переноса серии из 5 капсидов вирусных частиц разного размера и с разным количеством NLS. Они пришли к выводу, что для импорта исследованных грузов требуется 10 или более NLS и что количество NLS на объем груза является лучшей переменной, чем NLS на площадь поверхности груза, для прогнозирования количества ядерного поглощения. Хотя это интересные и потенциально полезные количественные результаты, есть серьезные проблемы с результатами, интерпретацией и предоставленными деталями, что умеряет мой энтузиазм.

Из 5 описанных капсидов вирусных частиц у авторов возникли технические трудности с двумя самыми большими, поэтому они не были включены в анализ. Таким образом, их реферат вводит в заблуждение, поскольку они не сообщают о кинетике для диапазона размеров 17-36 нм, а скорее 17-27 нм. Задачи с двумя самыми большими капсидами следует вынести в дополнительный раздел, чтобы не отвлекать от основной работы. Кроме того, грузы МС2 настолько плохо импортируются, что на их основе нет смысла делать серьезные выводы.Например, наклон для MS2 на рисунке 5A настолько пологий, что невозможно надежно определить минимальное количество NLS. Остальные грузы плохо себя ведут с точки зрения транспортной кинетики, как более подробно описано ниже.

Мы благодарим рецензента за обратную связь, но при всем уважении не согласны с несколькими моментами: хотя капсид MS2 показывает гораздо более низкую общую интенсивность ядерного импорта по сравнению с меньшими капсидами MS2_S37P и I53-47, сигнал, который мы измеряем, по-прежнему очень хорошо поддается количественному определению, значителен. и надежный (как видно из конфокальных изображений на рисунке 2 (вторая панель изображений на рисунке 2B была добавлена ​​для прямой визуализации импорта как для малых, так и для больших капсидов MS2).В то время как общая яркость отличается, сигнал импорта значительно увеличивается с течением времени для обоих капсидов), и на рисунке 3 наши данные показывают последовательную и надежную тенденцию NLS-зависимого импорта (см. кинетические кривые на рисунке 3B, внизу справа). Только потому, что все данные для разных капсидов нанесены вместе на один график, это кажется очень низким по сравнению с гораздо более эффективными капсидами меньшего размера. Мы утверждаем, что эта довольно неожиданно большая разница между эффективностью грузов повышает значимость нашей работы.В новом основном тексте на рисунках 5B и C показаны нормализованные данные. Здесь теперь ясно видно, что импорт имеет место и для большого MS2, что также очень хорошо объясняется нашей новой простой биофизической моделью.

Что касается «вводящего в заблуждение абстрактного» комментария, мы утверждаем, что результаты наших экспериментов с HBV не связаны с техническими трудностями, а представляют собой достоверные экспериментальные данные модели большого груза (HBV со сконструированными сигналами NLS). «Нет импорта» также является результатом, в частности, если рассматривать это в контексте широко распространенного утверждения о том, что самым большим из известных физиологических импортируемых грузов является ВГВ.Мы согласны с тем, что для условий «Нет импорта» мы показываем только кумулятивные косвенные доказательства, поскольку мы наблюдали это для трех совершенно разных капсидов HBV. Однако, как это часто бывает с экспериментальными исследованиями, это относится к испытательным условиям, и сейчас мы обсудим это более строго.

NLS случайным образом прикрепляются к поверхности капсида, что делает полученные популяции гетерогенными. Количественное количество NLS является средним, а анализ геля является полуколичественным.Некоторое обсуждение их ожидаемых ошибок оправдано.

Мы согласны с рецензентом в том, что количественная оценка количества NLS в геле представляет собой среднее значение реакции мечения (которое, как ожидается, будет распределено по Гауссу). В исправленной рукописи мы позаботились разъяснить это. Это действительно массовый эксперимент, и у нас нет разрешения на одну молекулу, чтобы выйти за пределы среднего по ансамблю, что, однако, не делает результат менее количественным. Мы видим очень четкое смещение полосы при добавлении NLS к белку.Поскольку NLS сам по себе небольшой, интенсивность полос Кумасси определяли после сканирования геля, окрашенного Кумасси, при тщательном анализе площади двух разных полос. На рис. 1C четко показаны две четко разделенные полосы для капсидов, меченных NLS, и капсидов, не меченных NLS. Гели демонстрируют высокую чистоту, а анализ очень надежен и, таким образом, дает непосредственные четкие, хорошо воспроизводимые измерения отношения мечения. Хотя анализ Кумасси может показаться базовым, не очень сложным инструментом, его результаты надежны и хорошо поддаются количественной оценке.Следуя предложению рецензента, мы расширили обсуждение количества определений NLS в разделе «Материалы и методы», чтобы лучше объяснить себя.

Единственный биологически значимый капсид (HBV), т. е. тот, который импортируется в ядро, не включен в их анализ. Физиологически этот капсид разбирается в ядерной корзине. Они удалили подлинный NLS для своих экспериментов. Таким образом, биологические последствия ограничены.

Наша цель в этой работе состояла в том, чтобы изучить общие свойства ядерного импорта с использованием крупногабаритных моделей грузов.Очень мало известно о биофизике крупногабаритного грузового транспорта, и мы думаем, что это в основном связано с тем, что большинство физиологических грузов не позволяют надежно изучить импорт крупногабаритных грузов. Возьмем в качестве примера HBV тот факт, что NLS зависит от фосфорилирования и потенциально также зависит от упаковки, а импорт может фактически потребовать разборки капсида, оставил нам много двусмысленности в литературе. Напротив, мы чувствуем, что наш редукционистский подход обеспечивает очень хороший путь к пониманию фундаментальных принципов. Кроме того, мы отмечаем, что транспорт HBV, как было показано, зависит от того же импортина α / β, который связывает используемую нами NLS, поэтому наша упрощенная и более контролируемая система все еще может быть полезной. Мы надеемся, что рецензент 1 может также быть убежден мнением рецензента 2, который особенно положительно комментирует выбор системы, написав: «Усилия похвальны, а использование модифицированных вирусных капсидов удивительно умно».

Кривые на рисунке 1D являются фактическими данными или подходят? В сигналах FCS и DLS преобладают крупные частицы, однако свободный краситель и/или меченые мономеры капсида могут значительно влиять на кривые импорта — ответственны ли они за пересечения с ненулевыми ординатами на рис. 3 — дополнение к рисунку 1? Можно ли отделить меченые капсиды от мономеров и свободного красителя методом эксклюзионной хроматографии?

На рисунке 1D показаны репрезентативные кривые данных FCS для измеренных капсидов, которые мы затем подогнали в Symphotime с помощью диффузионной модели. Как это часто бывает на трассах FCS, при коротких временах корреляции действительно виден очень небольшой шум. Мы согласны с беспокойством рецензента по поводу потенциального загрязнения и приложили значительные усилия, чтобы устранить это беспокойство. Короче говоря, мы выполнили следующее:

1) Наша стратегия маркировки делает невозможным обнаружение импорта мономера. Поскольку мы маркируем красителем и NLS отдельно, только более крупные структуры могут быть помечены как флуоресцентно, так и NLS. Чем больше становится сборка, тем больше вероятность того, что она улавливает загрязнения в нашем аналитическом конвейере (FCS, DLS и EM).

2) Экспериментально капсиды отделяют от избытка непрореагировавшего красителя с помощью эксклюзионной хроматографии и дополнительной стадии тангенциальной проточной фильтрации. Во время этого процесса образец подвергается обширной промывке, которая должна эффективно отделять мономеры с несколькими кДа и капсиды размером с МДа, и мы также отмечаем, что мы не наблюдаем никаких фрагментов капсида на окончательных изображениях ЭМ. Дальнейшая обширная характеристика каждого образца с помощью ЭМ, FCS и DLS привела нас к выводу, что основная часть нашего препарата состоит из интактных капсидов.Обратите внимание, что FCS и DLS чувствительны к существенным загрязнениям. Как указано выше (рис. 1D), наши данные FCS также хорошо подходят для одного вида.

3) Для сравнения, импорт очень мелких грузов следует совершенно другой кинетике (скорее секунды, см., например, Timney et al., 2006 и Ribbeck and Gorlich, 2001). Это устраняет проблемы загрязнения нашей кинетики в соответствующем временном масштабе. Однако очень большие сборки (например, половина капсида) могут легко исказить наш результат.Тем не менее, те, которые мы могли бы легко обнаружить с помощью ЭМ, и мы были очень строги в отношении качества наших данных ЭМ, продолжая только тогда, когда ЭМ показывала очень однородные почти только идеальные круглые структуры.

Теперь мы обсудим это лучше в разделе «Материалы и методы» и благодарим рецензента за указание на то, что эта часть не была достаточно ясной.

Авторы недооценивают важность свойств поверхности во многих местах по всему тексту. Но на самом деле они не проверяли это, а свойства поверхности на самом деле удивительно важны, как показали многочисленные исследования — изменение нескольких остатков или добавление флуоресцентных красителей может резко изменить импортные свойства грузов.На самом деле, я не удивлюсь, если изменение количества красителей в их грузах изменит наклон графиков на рис. 5, или некоторый разброс на этих графиках возникнет из-за соотношения краситель:груз:NLS. Как минимум, они должны смягчить дискуссию, выступая против минимального влияния свойств поверхности.

Хотя мы согласны с рецензентом в том, что свойства поверхности большинства (особенно пассивных) грузов являются ключевыми для темпов импорта ядерных материалов, наши данные указывают на второстепенную роль импорта крупных грузов, несущих несколько NLS.Мы существенно расширили наше обсуждение этого вопроса (см. раздел «Обсуждение» в основном тексте), где теперь мы подробно остановимся на том, насколько комплекс Importin в конечном итоге покрывает (экранирует) поверхность капсида, даже с простой геометрической точки зрения.

Что еще более важно, чтобы ответить на вопросы рецензентов, мы провели новые эксперименты, в которых мы напрямую сравнили капсиды MS2_S37P, меченные пептидом NLS, и модифицированным пептидом, имеющим дополнительные 5 зарядов на пептид: как видно на рисунке 5C, образцы с /без дополнительной оплаты вели себя очень похоже в тестах на импорт (сравните красные точки и квадраты).Это согласуется с нашим мнением о том, что богато украшенная поверхность груза в основном защищена связанными импА и импВ.

Хотя авторы ограничивают подгонку «первыми 40 минутами для получения более точной кинетики», на самом деле верно обратное. Точная аппроксимация экспоненциальной кинетики требует знания асимптотического предела, чего нельзя сказать о многочисленных кривых на рис. 3 — дополнение к рисунку 1. Кроме того, начальные моменты времени на этих кривых сильно различаются — это не ожидается и не обсуждается.

Мы благодарим рефери за это замечание и приносим извинения за то, что вызвали путаницу. Как мы объясняем в нашем «сводном поле основных изменений» в верхней части этого пункта, теперь мы подходим к этой теме гораздо более строго. В пересмотренной рукописи мы сосредоточили наш анализ на начальной скорости притока, которая (в отличие от долгосрочного устойчивого состояния) определяется кинетикой перемещения капсидов через поры. Мы обнаружили, что эта скорость более надежно извлекается путем подгонки данных с помощью моноэкспоненциальной функции (до 80 минут), чем линейной подгонки к первым нескольким точкам данных.Мы делаем это с пониманием того, что на долгосрочное устойчивое состояние могут влиять многие дополнительные факторы, и не делаем никаких выводов из параметров нашей моноэкспоненциальной аппроксимации в отношении окончательных значений устойчивого состояния — см. также ответ рецензенту 2. Чтобы подтвердить, что моноэкспоненциальная функция является хорошим приближением на коротких временах, мы исследовали вариант двойной экспоненциальной подгонки и обнаружили, что это не повышает качество подгонки. Более того, подгонка является «неаккуратной», в результате чего многие комбинации параметров дают подгонки сравнимого качества (что отражено в чрезвычайно высоких неопределенностях в подгонке двойных экспоненциальных значений параметров в дополнительном файле 2).Мы также отмечаем, что использование двойной экспоненциальной функции для извлечения начальной скорости дает практически те же значения, что и наши моноэкспоненциальные подборы (дополнительный файл 2, таблица 2). Мы надеемся, что эти моменты ясны в исправленной версии и развеют опасения рефери.

По техническим причинам наша первая точка измерения задерживается на 2 минуты после добавления капсидов, поэтому к этому времени капсиды с разными свойствами накапливаются до несколько разных уровней – это может быть источником разброса «начального значения», вместе с минимально различными уровнями неспецифического фонового сигнала. Таким образом, в первые минуты потенциально сложная комбинация капсида, диффундирующего в клетки, неспецифически прилипающего к покровному стеклу или клеточным мембранам и рекрутируемого в ядерную оболочку, может вызвать различную начальную флуоресценцию. Мы переработали текст, чтобы прояснить этот момент.

Мы также хотим отметить, что мы протестировали наш новый конвейер анализа на надежность подбора 80 мин по сравнению с 40 мин, и, к счастью, результаты согласуются в обоих диапазонах подбора.

Для 80-минутных временных точек авторам действительно следует рассмотреть возможность включения CAS, RanGAP и RanBP1, чтобы поддерживать полную рециркуляцию транспортных факторов.

Контрольные эксперименты, включая CAS, избыток GTP, избыток Importinα и отсутствие по сравнению с наличием системы регенерирования энергии на рисунке 2 — дополнение к рисунку 1, показывают, что общее поведение насыщения сохраняется также в этих условиях. В частности, мы решаем эту проблему с помощью нового эксперимента: теперь мы провели эксперименты in vivo, в которых мы микроинъецировали живые ооциты морских звезд с теми же репрезентативными образцами капсида. Эксперименты in vivo качественно хорошо согласуются с нашими данными о пермеабилизированных клетках в поддержку всех наших выводов (см. новый рисунок 2 — дополнение к рисунку 2).Обратите внимание, что эксперименты in vivo имеют чрезвычайно низкую производительность и их просто намного сложнее количественно оценить (капли масла, прилипание, пространственная неоднородность и т. д., см. рис. 2 — дополнение к рисунку 2 для более подробной информации). Анализы пермеабилизированных клеток (хотя и непростые при работе с очень большими капсидными грузами) гораздо меньше страдают от этих проблем.

«Нормированная ядерная интенсивность» нуждается в пояснении. Относительно чего? Соответствуют ли они одному и тому же масштабу для разных участков? Что означает интенсивность 1? Как это связано с интенсивностью на рисунке 1D? Эффективность ядерного поглощения различных грузов сильно различается, но это не обсуждается.

Мы расширили обсуждение анализа данных, чтобы лучше объяснить, как мы получаем скорректированные интенсивности ядер для сравнения их между различными капсидами. Вкратце, необработанные значения интенсивности (например, следы на рисунке 2D) вычитаются из фона и корректируются для индивидуальной яркости капсида (оценивается по FCS). Затем эти трассы подгоняются и анализируются. Для наглядности мы построили кинетическую кривую за вычетом параметра смещения A на рисунке 2.

Энергетическое обсуждение в последнем абзаце не имеет большого смысла без оценки энтропийной стоимости смещения барьера проницаемости.

В нашей пересмотренной рукописи мы полностью пересмотрели биофизический анализ последствий наших результатов. В сотрудничестве с лабораторией Зильмана (теперь включенной в статью в качестве соавторов) мы проанализировали данные через призму минимальной теоретической модели, основанной на предыдущих экспериментальных и теоретических результатах, которая включает в себя основные физические представления о кинетике и энергетике. капсидная транслокация.В частности, модель позволяет оценить свободную энергию внедрения капсида в NPC. Модель очень хорошо отражает наши экспериментально измеренные темпы импорта, как видно на рисунке 5C.

Рецензент №2:

Рукопись Пачи и Лемке описывает эксперименты, направленные на накопление в ядрах крупных NLS-меченых грузов. Усилия похвальны, а использование модифицированных вирусных капсидов удивительно умно. Однако у меня есть некоторые серьезные проблемы с интерпретацией.

Благодарим рецензента за отзыв о нашей работе. Следуя всем предложениям рецензентов, мы существенно переработали рукопись и расширили некоторые пункты новыми вспомогательными данными (как экспериментальными, так и теоретическими). Мы резюмировали основные изменения в нашем «кратком обзоре основных изменений» в начале этого пункта за пунктом, и любезно попросите этого рецензента прочитать его, прежде чем углубляться в подробное пошаговое обсуждение ниже.

Эксперименты основаны на анализе пермеабилизированных клеток.Они являются стандартными в этой области, к лучшему или к худшему, но они страдают общей проблемой, заключающейся в том, что остальная часть клетки вымывается. В живой клетке интересующий транспортный субстрат должен конкурировать с остальной частью протеома за внимание транспортных рецепторов. Это может оказать существенное влияние на кинетику транспорта.

Мы согласны с рецензентом в том, что анализ пермеабилизированных клеток может не отражать все аспекты живой клетки. Чтобы еще больше подтвердить наши результаты, мы теперь добавили экспериментальный набор данных, изучающий импорт наших больших грузов в ооциты живых морских звезд с микроинъекциями (рис. 2 — дополнение к рисунку 2).Эти эксперименты чрезвычайно трудоемки и имеют низкую пропускную способность по сравнению с анализами пермеабилизированных клеток, поэтому мы не могли стремиться к тому же уровню характеристики для десятков образцов. Кроме того, технические трудности делают их менее количественными, чем очень хорошо зарекомендовавший себя анализ пермеабилизированных клеток, который также служит здесь для сравнения наших результатов со стандартом в этой области. Тем не менее, мы смогли протестировать репрезентативные образцы из трех основных грузов, проанализированных в статье, и смогли подтвердить, что их поведение в интактных живых клетках соответствует тому, что мы наблюдаем в анализах пермеабилизированных клеток (см. новый рисунок 2 — дополнение к рисунку 2).

Как и в большинстве исследований ядерной аккумуляции, в анализе не проводится должного различия между проницаемостью ядерной оболочки и уровнем насыщения ядерной концентрации. Последнее признается «надежным ядерным импортом», но совершенно очевидно зависит от системы RanGTP. Предположение, что моноэкспоненциальная (первого порядка) кинетика измеряет проницаемость через ядерные поры, просто не оправдано. Наблюдаемая кинетика отражает стадию ограничения скорости, которая может быть перезарядкой Ran с помощью GTP или рециркуляцией в цитоплазму.См. Kim and Elbaum, 2013, и намного ранее Smith et al., 2002.

Мы благодарим рефери за это прекрасное замечание и сожалеем, что оно не было ясно в предыдущей версии. Действительно, на конечные уровни накопления ядер в стационарном состоянии влияют многие факторы, такие как доступность NTR, Ran, Rcc1 и другие факторы. В частности, теоретическая работа Эльбаума и Кима показывает возможность немоноэкспоненциального подхода к стационарному состоянию, когда приток грузов уравновешивается оттоком.

Чтобы развеять опасения рецензента, наш анализ в пересмотренной рукописи теперь сосредоточен на начальной скорости импорта ядер (см. новый рисунок 5), которая не зависит от долговременной формы кривой интенсивности; подчеркнем, что мы полагаемся на моноэкспоненциальную подгонку только для извлечения значений начальных ставок импорта (эти подгонки показаны на рис. 3 — дополнение к рис. 1). Ожидается, что на этой начальной стадии увеличение ядерной флуоресценции будет происходить исключительно из-за импорта капсидов в ядро, в то время как кинетика диссоциации груза от транспортных рецепторов и дальнейшие этапы цикла Ran должны иметь лишь минимальный эффект.

Кроме того, мы повторно исследовали пригодность моноэкспоненциальной аппроксимации для этой коротковременной кинетики и обнаружили, что это превосходное приближение в интересующем нас режиме. Двойные экспоненциальные подгонки не обеспечивают заметного улучшения качества подгонки; с другой стороны, они «неаккуратны» — в результате чего многие комбинации параметров обеспечивают подгонку сопоставимого качества (что отражено в чрезвычайно высоких неопределенностях значений параметров для двойной экспоненциальной подгонки (новый дополнительный файл 2) и не дают очень разные оценки начальных ставок импорта (новый дополнительный файл 2, таблица 2).Наконец, мы также отмечаем, что эмпирически моноэкспоненциальная кинетика импорта является очень распространенным наблюдением в литературе, в том числе в экспериментальной работе Копито и Эльбаума, 2007.

На количественные измерения ядерного накопления может влиять, кроме того, связывание со структурами внутри ядра, как показано на рисунках 3 для MS2 с высоким количеством NLS. Каждый NLS добавляет значительное количество положительного заряда. Это может сильно повлиять на связывание с нуклеиновыми кислотами, когда они присутствуют в такой высокой локальной концентрации на вирусном капсиде, особенно если белки, связывающие ДНК/РНК, теряются при пермеабилизации.

Мы согласны с рецензентом в том, что секвестрация груза путем привязки к ядерным конструкциям может повлиять на темпы импорта ядерных материалов; однако новый набор экспериментальных данных, который мы добавили с использованием заряженных пептидов NLS (рис. 5), подтверждает картину, в которой этот вклад не является существенным. Кроме того, наш улучшенный анализ фокусируется на начальной норме импорта, на которую накопление сборов повлияет минимально.

В тексте рассматривается уровень накопления ядер («конечная точка» на рис. 5), но представленные графики показывают кинетику накопления, а не насыщение в зависимости от #NLS.Время полунасыщения, (I(t) – A)/Imax = 1/2, фактически равно ln2/k, а не ln2/Imax, как написано в тексте (подраздел «Анализ изображений и данных»). Глядя на таблицу в дополнительном файле 1, значения для T_1/2 указаны равными 1/2 * ln2/k. У этого есть правильные единицы, но я не понимаю фактор 1/2.

Рецензент прав, и мы действительно извлекли полунасыщенность как ln2/k (см. дополнительный файл 1). Мы расширили наше обсуждение, чтобы лучше прояснить информацию, извлеченную из данных, а также следуя рекомендациям всех рецензентов, теперь у нас есть количественный анализ и комбинация с биофизической моделью начальной скорости транспорта, которую можно экстраполировать из подгонки. параметров и является гораздо более надежным, как обсуждалось выше.

Если целью упражнения является изучение степени накопления, т. е. Imax, то подходящим параметром для измерения является ядерно-цитоплазматическое отношение N:C при насыщении. Логарифм этого отношения есть разность химических потенциалов, которая является существенной термодинамической величиной. Как представлено, данные не показывают цитоплазматическую интенсивность, и примененная коррекция фона не описана. На рис. 2C показан единственный пример цитоплазматической интенсивности, при котором ядерно-цитоплазматическое отношение насыщается примерно при 10 (700/70 единиц на графике).

Как упоминалось выше и следуя предложению рецензента, мы теперь вместо этого сосредоточим наш анализ на начальной скорости импорта, которая изолирует этап перемещения через NPC от оттока, на который может повлиять множество факторов. Мы согласны с рецензентом в том, что отношение N:C потенциально может отражать эффективность транспортировки различных грузов, но мы должны отметить, что эта величина, к сожалению, недостаточно надежна в случае нашей выборки, чтобы можно было провести тщательное сравнение всех выборок.Это связано с тем, что некоторые капсиды имеют неспецифические взаимодействия с цитоплазматическими структурами и мембранами (см., например, рисунок 3A, I53-47 в отсутствие NLS), что не позволяет нам извлекать чистый и надежный цитоплазматический сигнал из всех образцов.

Поскольку внешняя по отношению к клеткам флуоресценция, исходящая от титрованных грузовых субстратов, должна уравновешиваться флуоресценцией в цитоплазме, я решил посмотреть, можно ли включить это в подгоночный параметр A. Было неясно, является ли A самой поправкой на фон или подходит после применения коррекции.В любом случае А не может представлять флуоресценцию от свободного груза. Согласно тексту они вводятся в постоянной концентрации 8 нМ, но значения, указанные в дополнительном файле, сильно различаются даже для данного класса груза. Почему они должны так сильно различаться? По-видимому, эти значения скорректированы на тот же коэффициент, что и Imax для яркости подложки. Если их не исправить, разве капсиды с меньшим количеством NLS не должны казаться ярче, то есть с большим A? В некоторых случаях A составляет очень большую часть Imax, что оставляет небольшой динамический диапазон для самого измерения.(Сравните I53-47 с 15, 18 и 22 NLS.) В принципе, вычитаемый уровень черного соответствует уровню конфокального микроскопа с заблокированным лазером, а флуоресценция в окружающей среде должна совпадать с измеренной в пермеабилизированной цитоплазме. Если в измерительном канале клетки автофлуоресцируют, то потребуется некоторая дополнительная коррекция, но она должна быть четко указана.

A — параметр смещения, используемый при подгонке скорректированных кинетических кривых. Все трассы были скорректированы с учетом яркости груза (оценка по FCS) и фона ФЭУ микроскопа перед подгонкой.По техническим причинам наша первая точка измерения задерживается на 2 минуты после добавления капсидов, и поэтому к этому времени капсиды с разными свойствами накапливаются до несколько разных уровней. В эти начальные минуты потенциально сложная комбинация капсида, диффундирующего в клетки, неспецифически прилипающего к покровному стеклу или клеточным мембранам и рекрутируемого в ядерную оболочку, может вызвать различную начальную флуоресценцию. Мы переработали текст, чтобы прояснить этот момент.

Несколько относительно технических моментов:

Почему мечение флуоресцентным красителем и NLS выполнялось как на цистеине? Белки могли быть помечены сначала по лизину, а затем с помощью NLS по цистеину. Проблема в том, что молекулярная масса красителя почти вдвое меньше, чем у пептида. Доступен ли контроль, показывающий, что маркировка красителем действительно не влияет на подвижность геля? Рисунок 1 — приложение к рисунку 1 показывает как кумасси, так и флуоресценцию при «неудачном» мечении I53-50.Для ясности основной рисунок должен также показывать флуоресценцию в успешном случае.

Следуя предложению рецензента, мы добавили изображение сигнала флуоресценции в меченых образцах на рисунке 1C. В контрольных образцах без NLS мы убедились, что нет существенного влияния на подвижность геля (постоянно наблюдается четкая одиночная полоса). Кроме того, NLS включает в себя множество K, и многие из них имеют функциональное значение: стратегия мечения цистеином гарантирует, что мы не нарушаем функциональность и что мы добавляем максимум одну метку на мономерную субъединицу.Наличие двух мест мечения на одном мономере может вызвать проблемы с загрязнением кинетических сигналов из-за очень маленьких капсидов (см. также наш ответ рецензенту 1 относительно точки загрязнения из-за сломанных капсидов).

Я не понял игрушечную модель в подразделе «Глобальный количественный анализ ядерного импорта в зависимости от размера груза и #NLS». Энергия связывания NTR с грузом не способствует направленной транслокации и не передается на смещение FG-повторов.Это зависит от взаимодействия NTR с мотивами FG. Сгущение в ядерной поре, как показано на рисунке 5, представляет интерес и может быть связано с кинетикой, но не с концентрацией насыщения («конечная точка»).

В нашей пересмотренной рукописи мы полностью переработали (см. рамку в начале этого pbyp) эту часть, проанализировав данные с использованием минимальной биофизической модели, основанной на предыдущих исследованиях термодинамической проницаемости сборок FG-Nup in vitro, и кинетика транспорта через NPC, имитирующие нанопоры и NPC в пермеабилизированных клетках.Модель позволяет нам исследовать основной вклад в кинетику транспорта: стоимость свободной энергии при вставке капсида NPC и энергетический выигрыш от взаимодействий между мотивами NTR и FG. Модель и соответствующий анализ теперь описаны в подразделе «Количественный анализ ядерного импорта по отношению к размеру груза и #NLS» и на новом рисунке 5C.

Ядерный экспорт — это не просто обратная сторона импорта. См. Kim and Elbaum, 2013. Существует принципиальное различие между обменом RanGTP, обратимой реакцией при «импорте», и физиологически необратимым гидролизом GTP, который сопряжен с транслокацией при «экспорте».

Теперь мы пересмотрели соответствующую часть текста, чтобы лучше отразить различия между механизмами импорта и экспорта.

Рукопись слишком длинная для краткого отчета, около 3500 слов только в основном тексте.

После дальнейшего расширения нашей работы с новыми данными и теоретической моделью мы изменили формат на исследовательскую статью.

В надежде закончить на конструктивной ноте, я должен извиниться за то, что был здесь таким раздражительным рецензентом. Мне очень нравится эксперимент, и я считаю, что полученные данные содержат некоторые новые истины, которые предстоит открыть. Где бы эта работа ни была опубликована, мне бы очень хотелось, чтобы накопление ядер было представлено в виде отношения ядер к цитоплазме. Это позволит нормализовать по своей природе яркость субстрата и избежать потенциальных несоответствий, связанных с числами из других измерений, неточными разведениями, потерями белка при агрегации и т. д. Конечно, данные доступны и не требуют каких-либо дополнительных экспериментов.Я уверен, что их можно было бы легко проанализировать повторно, избегая путаницы между кинетикой и насыщением. Построение соотношения прояснит, действительно ли дополнительное количество NLS влияет на кинетику и насыщение, как предполагалось. В магазине могут быть сюрпризы.

Мы благодарим рецензента за его конструктивную критику и добавление этого обнадеживающего и мотивирующего примечания. Мы согласны с рецензентом в том, что было бы неплохо провести анализ соотношения ядер и цитоплазмы, и именно это мы изначально и пытались сделать. Однако из-за разной липкости больших структур капсида к клеточным структурам соотношение ядра и цитоплазмы не дает надежных результатов. На самом деле, как написано в основном тексте, эти капсидные структуры уже являются лучшими, которые мы определили из гораздо большего набора «больших структур», которые мы пытались сделать пригодными для этих экспериментов.

Тем не менее, мы убеждены, что наш значительно улучшенный конвейер анализа и полностью пересмотренная стратегия подбора хорошо справляются со всеми проблемами, отмеченными рецензентами, поэтому мы надеемся, что статья теперь может быть опубликована.

[Примечание редактора: далее следует ответ авторов на второй этап рецензирования.]

Один из первоначальных рецензентов считает, что рукопись была улучшена, но у него есть некоторые проблемы с интерпретацией данных и моделью. В частности, рецензент заявляет: «Особое внимание следует уделить прогнозам модели и интерпретациям в контексте этой модели». Этот рецензент был тщательным в оценке, поэтому мы считаем, что комментарии могут быть полезны для дальнейшего улучшения рукописи.

Поскольку на вопросы можно ответить без дополнительных данных, а требуется только доработка рукописи или пояснения для рецензента, мы решили отправить ее обратно вам для устранения этих комментариев.

Рецензент 1:

Эта переработанная рукопись была существенно улучшена за счет более жесткого обсуждения и презентации, чтобы сосредоточиться на основной истории, а также за счет добавления математической модели. Тем не менее, у меня есть некоторые опасения по поводу исправленной рукописи, перечисленные ниже в порядке важности.В то время как некоторые из этих пунктов касаются точности и логической последовательности, другие части предназначены для создания более детальной и информативной картины. Особое внимание следует уделить предсказаниям модели и интерпретациям в контексте этой модели.

Благодарим рецензента за конструктивный отзыв о нашей работе.

1) Рисунок 5B. Модель убедительно объясняет значения на графике. Однако все значения ∆G положительны, что свидетельствует о неблагоприятном связывании с барьером проницаемости.Тем не менее во время экспериментов по импорту отчетливо виден ядерный римминг, что указывает на то, что взаимодействие с порой является благоприятным — более благоприятным, чем нахождение в цитоплазматическом компартменте. Это указывает на то, что NPC является термодинамическим стоком. Таким образом, данные кажутся несовместимыми с моделью, которая постулирует только энергетический барьер. Модель на рисунке 5 — дополнение к рисунку 4 напоминает модель вестибюля Ту и др., 2013), но и здесь ни одно из значений ∆G не является отрицательным (как это было в случае Ту и др.). Пожалуйста, обсудите.

Это отличный вопрос, и мы сожалеем, что он не был ясно объяснен в предыдущей версии. Ядерная окантовка без существенного накопления ядер предполагает, что капсиды благоприятно взаимодействуют с некоторыми областями NPC, однако не обязательно со всеми областями, поскольку в противном случае было бы видно накопление ядер.

В этом отношении вариант изображения вестибюля обеспечивает одно из возможных решений этого кажущегося противоречия. При пространственно-неоднородном эффективном потенциале внутри НПК в усредненном ΔG преобладают области потенциала, имеющие более высокое (более положительное) значение, а грузы по-прежнему накапливаются в областях с низким локальным ΔG .Это может быть термодинамический сток с локально отрицательной свободной энергией, даже если глобальное значение ΔG положительно.

В случае NPC наиболее вероятным объяснением «окантовки» является область относительно низкой плотности — диффузное «облако» FG nup плотности на цитоплазматической стороне с очень низкой стоимостью проникновения. Эта область была отмечена как у Tu et al. (как «цитоплазматический вестибюль»), так и у Lowe et al., 2010 как цитоплазматическая «стыковочная» область.

Чтобы решить проблему рецензента, мы теперь явным образом включили цитоплазматическую область «стыковки/вестибюля» в профиль свободной энергии, как показано на рисунке 5 — дополнение к рисунку 4. Отметим, что наличие такого вестибюля минимально влияет на поток через пору, так как свойства селективности пор в большей степени определяются барьерной областью.

Мы согласны с рецензентом, что детальное сравнение разных моделей важно. Однако подчеркнем, что однозначно решить эти вопросы на основании только объемных измерений невозможно. Текущая минимальная модель, которая подтверждается данными, предлагает рекомендации по интерпретации данных, и мы отправляем более подробные модели в будущую работу с отслеживанием отдельных молекул.

2) Они цитируют четыре ссылки на исходное уравнение потока (2, 33-35). Я не могу найти уравнение, которое они используют в этих ссылках. На самом деле, два из них описывают поток как константу, умноженную на разность концентраций, что кажется несовместимым с их уравнением. Необходимо дополнительное обсуждение, чтобы выяснить, откуда взялась эта модель.

Приносим извинения за путаницу в ссылках. Мы обновили их и расширили объяснение формулы в основном тексте. Отметим также, что в случае (идеальных) невзаимодействующих грузов поток из цитоплазмы в ядро ​​J→=kONcCa+eΔG, обратный поток J→=kONcNa+eΔG (без учета Ran-осложнений) а общий поток через пору равен J→−J ←=kON(cC−cN)a+e∆G, так что все эти формулировки согласуются друг с другом (в режиме справедливости аппроксимации).

3) Если я правильно понимаю методы, то NLS и красители одновременно смешивались с капсидами.Они обсуждают настройку соотношения NLS/капсид, и это в конечном итоге определяется с помощью анализа сдвига геля. А как насчет количества красителей на капсид? Похоже, у них есть данные о яркости из экспериментов FCS, и об этом следует сообщить. Изменяется ли количество красителей обратно пропорционально количеству NLS? Они по-прежнему сводят к минимуму роль свойств поверхности, но, как показали Ту и др., Несколько дополнительных молекул красителя резко влияют на свойства проницаемости груза. Я не считаю безопасным предполагать, что количество молекул красителя не влияет на силу взаимодействия частицы с NPC.

В нашем экспериментальном потоке мы количественно определяем количество красителей на капсид с помощью FCS: следуя предложению рецензента, мы теперь включили значения яркости капсида в Таблицу 1. Во всем нашем наборе данных мы не находим сильной корреляции между NLS и количеством красителя. (R ² =0,22). Точно так же мы не видим корреляции коэффициента маркировки с исходным потоком импорта (R ² =0,14). В случае груза, используемого в Tu et al. В исследовании ферментативная активность ΒGal (дисахаридгидролаза, потенциально связывающая дисахариды в NPC) также способствовала неспецифическому импорту, требующему в общей сложности 4 мутаций для получения специфического импортного груза.Возможно, что резкий эффект добавления красителей 8 против 16 несколько специфичен для груза ΒGal и его поверхности, поскольку та же группа ранее сообщала, что присутствие 4 красителей Alexa 647 не влияло на взаимодействие importinα-2XGFP-NLS и нахождение груза. времени (Сан и др., 2008). Наши грузы не представляют сложностей в виде ферментативной активности ΒGal, а для случая 0 NLS мы явно не видим никакого импорта даже при наличии высоких красителей (до 23 для груза MS2S37P, наиболее сравнимого с ΒGal) и после гораздо более длительного ожидания (1.5-2 часа).

Кроме того, форма ВGal сильно отличается от наших сферических капсидов (цилиндрических с диаметром всего 9 нм по меньшей оси), что по сравнению с нашим исследованием делает ВГал небольшим(более) грузом. Следуя рекомендации рецензента, см. также ниже, мы теперь гораздо более тщательно обсуждаем эффект поверхностного экранирования, о котором мы предполагаем для наших больших сферических структур из-за покрытия Importin. Это может не иметь отношения к BBal только для Importins.Кроме того, тема маркировки красителей теперь обсуждается более тщательно.

Более того, они заявляют, что F(R) масштабируется с радиусом, однако полученные ими значения F(R) практически одинаковы, что согласуется с различными поверхностными свойствами капсидов разного диаметра. Заявление об этом не умаляет их результатов.

Это отличное замечание, и мы снова сожалеем, что оно было неясным в предыдущей версии. Теоретические (и разумные) ожидания заключаются в том, что стоимость вставки должна увеличиваться с размером капсида.Однако конкретные прогнозы были получены только для размеров частиц, намного меньших, чем изученные в этой статье, и служат только для руководства предположениями модели.

Одной из возможных технических причин сходства наблюдаемых значений F(R) является то, что поток капсидов без NTR настолько низок, что выходит за пределы шумового порога экспериментального обнаружения, что приводит к сходным значениям F(R). Чтобы исключить эту возможность, мы повторно провели анализ, исключив теперь нулевую точку NLS из подбора модели, и результаты анализа существенно не изменились.Теперь это включено в рисунок 5 — приложение к рисунку 5.

Другие возможные причины заключаются в том, что для таких больших капсидов, приводящих к экстремальному сжатию зародышей FG, стоимость вставки по существу достигает своего максимального значения. Мы изменили текст соответствующим образом, чтобы отразить этот момент.

Наконец, мы согласны с рецензентом в том, что на данный момент мы не можем исключить возможность того, что, по крайней мере, при очень низком охвате NTR (где мы практически не можем надежно обнаружить какой-либо поток экспериментально) поверхностные эффекты могут играть роль.Мы также добавили это в пересмотренное обсуждение.

4) Значения эпсилон удивительно малы. Для груза Ту и др. Это предсказывает очень малую силу взаимодействия полностью декорированного груза и еще меньше для одного груза, связанного с NTR, который, тем не менее, все еще четко связывается с порой. Обратите внимание, что размер (занимаемый объем) β-галактозидазы меньше, чем у MS2 (S37P), в том же отношении, что и размер MS2 (S37P), меньше, чем у I53-47. Было бы действительно удивительно, если бы существенные поведенческие различия грузов β-галактозидазы и MS2(S37P) можно было бы приписать только различиям в размере и форме. Представляется, что свойства поверхности должны хотя бы частично способствовать наблюдаемым различиям.

Благодарим судью за этот вопрос. Мы отмечаем, что здесь есть две отдельные проблемы: (1) независимый от модели экспериментальный факт, что даже самый маленький капсид MS2(S37P) требует значительно большего количества связанных NTR, чем груз ВGal, использованный в Tu et al., и (2) небольшой ( в 5-6 раз меньшие, чем в Ту и др.,) значения эффективной энергии связи ϵ на НТР в модели, что отражает экспериментальный факт 1.

Трудно проводить подробные количественные сравнения между различными экспериментальными платформами из-за присущей им неопределенности экспериментальных условий. Однако мы считаем, что очевидные расхождения между этой работой и Tu et al. могут быть связаны со следующими факторами.

Конструкция ΒGal, разработанная Tu et al., представляет собой молекулу примерно цилиндрической формы с размером 18 нм по самой длинной оси, аналогичную MS2 ^S37P . Однако его меньшая ось составляет 9 нм с соответственно более низкой стоимостью вставки, что может хорошо объяснить, почему для этой подложки 4 NLS может быть достаточно для импорта.

Мы хотели бы уточнить, что значения ϵ в таблице 1 физически реалистичны. Величина эффективной энергии ϵ на НТР представляет собой произведение затравочной энергии ϵ0 и средней объемной доли ϕ FG-мотивов внутри поры. Используя общие оценки числа мотивов FG в поре порядка ϕ≃0,01, чистая энергия взаимодействия между одним мотивом NTR и одним мотивом FG составляет порядка ϵ0≃3-12kBT (и до 15kBT в модели вестибюля). , согласно Tu et al. и другие измерения взаимодействия NTR-FG (например, группой Lim).Мы обновили рукопись, чтобы уточнить этот момент.

На данный момент мы не можем исключить, что различия между поверхностными свойствами наших капсидов и конструкцией ΒGal могут способствовать наблюдаемым различиям при низком покрытии NTR, и теперь мы соответствующим образом изменили текст. Также возможно, что при низком NTR наши значения ϵ могут быть ближе к значениям Tu et al. Однако маловероятно, что они будут основным объяснением при высоком охвате NTR, которому посвящена данная работа.При высоком охвате NTR потенциальными источниками несоответствия может быть более низкая доступность мотивов FG из-за чрезмерного сжатия зародышей FG и/или конкуренции между мотивами FG за NTR на капсиде.

Мы прояснили эти вопросы в тексте и надеемся, что в текущей форме рукопись развеет опасения рецензента.

Наконец, было замечено, что форма груза влияет на транспортные свойства: пассивные удлиненные грузы транспортируются быстрее, чем сферические грузы того же размера (Mohr et al., 2009), и это, вероятно, даже сильнее в случае больших грузов, например, учитывая бакуловирусы, которым необходимо специально ориентироваться вдоль своей длинной оси, чтобы проникнуть через NPC.

5) Раздел обсуждения – я не понимаю этих расчетов покрытия поверхности. Для максимальных значений NLS 38, 35 и 98 для MS2(S37P), I53-47 и MS2 я получаю покрытие поверхности 84%, 42% и 85%, предполагая 20 нм ² /β.

Для расчетов поверхности мы взяли образцы с самыми высокими номерами NLS, соответственно 54, 44 и 98 для трех капсидов (см. Таблицу 1).Это объясняет разницу в рассчитанных значениях, и теперь мы лучше разъяснили это в тексте.

Сюда не входит импортин α. Насколько увеличиваются диаметры при полном покрытии Importins α и β? Ожидается, что это будет значительным. Как этот увеличенный диаметр соотносится с размером канала?

Как правильно отмечает рецензент, для простоты мы не учитывали импортин α в наших приблизительных оценках покрытия поверхности.Принимая глобулярную конформацию связанного импортина β, мы могли бы ожидать радиального увеличения на 9 нм в случае 100% украшения поверхности груза NTR. Импортные комплексы тогда будут иметь общий диаметр 34, 40 и 44, достигая размера, сравнимого с самим каналом каркаса (примерно 40 нм).

Тем не менее, мы хотели бы подчеркнуть, что эти оценки увеличения размера, по нашему мнению, не являются определенно значимыми. Если принять во внимание все больше доказательств того, что импортины являются неотъемлемой частью барьера проницаемости (как, например, в обзоре Lim et al., 2015) и комплексы FG-Nups/NTR очень динамичны (см. Milles et al., 2015 и Hough et al., 2015), поэтому FG-Nups могут легко проникать в комплекс груз-импорт. В таких случаях дополнительный слой за счет покрытия Импортином не обеспечивает эффективного увеличения объема перевозимого груза, так как этот слой является частью транспортных средств и легко проникает в НИП, которые взаимодействуют с Импортином.

Таким образом, мы считаем, что более целесообразно сосредоточиться на размере груза без груза (который мы могли бы рассматривать как объем, исключенный из FG-Nup), и соответствующим образом сравнить результаты.

Имеются ли какие-либо экспериментальные доказательства того, что все NLS на капсидах связаны с NTR? Принимая во внимание, что концентрации и Kd (~ 40 нМ, α для NLS) аналогичны, NLS на капсиде MS2 заполнены только примерно на 90%, что означает покрытие поверхности на 77%. Хотя эти изменения могут существенно не изменить их интерпретацию, необходимо более подробное обсуждение для построения точной картины и уверенности в выводах. Другие потенциальные сложности: (1) возможно ли геометрически, чтобы все NTR на капсиде были связаны с повторами FG? Рисунок 5А предполагает, что это может быть невозможно;

Чтобы обеспечить максимальное связывание груза и NTR, мы всегда использовали избыток импортинов и предварительно инкубировали их в высокой концентрации с грузом до начала эксперимента.В измерениях DLS смеси груз + транспорт мы обнаруживаем два пика, соответствующие капсидам и небольшим белкам в смеси, если мы инкубируем капсид и импортины, мы обнаруживаем только капсидный пик, указывая на то, что большинство импортинов связаны. Действительно, это не обязательно обеспечивает полное насыщение NLS, но, как указывает сам обозреватель, все равно не меняет результатов, ведь мы всегда сравниваем грузы друг с другом в одинаковых условиях. Что касается связывания NTR с повторами FG, мы не видим, как (возможно, упрощенная) схема на рисунке 5A предполагает, что это невозможно: FG-Nup очень гибкие и могут легко растягиваться на несколько десятков нм, поэтому они могут легко оборачиваем импортный грузовой комплекс.Для простоты мы представили это на схеме довольно упрощенно.

Конечно, действительно возможно, что в данный момент данный NTR не связан с мотивом FG ни в одном из сайтов связывания на NTR. Однако, когда в нашей статье 2015 года мы выполнили расчет игрушечной модели только для двух сайтов связывания, мы увидели, что вероятность отсутствия связи резко падает по сравнению с моделью связывания с одним сайтом. Учитывая, что Importins и Nups очень поливалентны, это становится маловероятным.В этом отношении ε представляет собой 90 263 среднюю 90 264 энергию связи NTR с доменами FG, которая уже включает эту возможность.

и (2) могут ли несколько капсидов одновременно связываться с одной порой? Избыток груза, медленный импорт и ядерная окантовка предполагают такую ​​возможность. Не повлияет ли это на интерпретацию?

Хотя мы не можем с абсолютной уверенностью исключить множественные связывания капсидов с одной порой – и об этом действительно сообщалось в ЭМ капсидов ВГВ, введенных в ооциты Xenopus (Pante and Kann, 2002) – простые теоретические оценки показывают, что они, вероятно, ниже вероятность событий в наших экспериментальных условиях, по крайней мере, в начальный период, важный для расчета начального потока, который находится в центре внимания нашего анализа.

6) Неясно, есть ли какой-либо смысл в значениях A. Они очень изменчивы, и я не знаю, что с ними делать. В принципе, A может отражать накопление грузов на ядерной оболочке, но, поскольку это происходит в результате экстраполяции на нулевое время, кажется, что на самом деле оно должно быть равно нулю или, по крайней мере, какому-то разумно объясненному значению. Одна из возможностей заключается в том, что скорость импорта может зависеть от количества скопившегося груза в порах, т. е. скорость выпуска, так как вход в NPC происходит очень быстро.

Мы связываем различия в значениях A с ограничениями в экспериментальном плане: (i) начало эксперимента дается ручным пипетированием раствора капсида в лунку. Мы всегда визуализируем две лунки (каждая из 8 областей) параллельно, используя процедуру автоматизированного сбора данных. Различные капсиды должны диффундировать в клетки и могут рекрутироваться в ядерную оболочку с несколько иной начальной скоростью. Немного другое накопление груза в первые 2 минуты эксперимента до начала эксперимента характерно для разрешения ручного пипетирования, определяющего начало.(ii) Кроме того, мы наблюдали различную степень неспецифической адгезии образцов капсида к клеточным мембранам, что можно увидеть, например, при сравнении конфокальных изображений MS2 ^S37P и I53-47 на рисунке 3. Обратите внимание, что мы не извлекаем никаких интерпретаций из этого параметра смещения, а просто используем его для учета этой сложной смеси эффектов, приводящих к несколько отличающимся начальным значениям. Наконец, этот параметр очень чувствителен к несовершенствам кинетической подгонки, что может быть дополнительным фактором, влияющим на его различные значения.

7) Данные по отрицательно заряженным линкерам в лучшем случае неубедительны, так как они сильно разбросаны. Их выводы следует смягчить.

После отзыва рецензента мы смягчили обсуждение экспериментов с заряженными линкерами.

[Примечание редактора: далее следует ответ авторов на второй этап рецензирования.]

Рукопись была улучшена, но остались некоторые проблемы, которые необходимо решить перед принятием, как указано ниже:

Один рецензент считает, что рукопись существенно улучшена, но остается нерешенный вопрос, который не был исправлен в редакции.Рецензент считает, что рисунок 5 — дополнение к рисунку 4 необходимо уточнить, как описано ниже. Также включены дополнительные незначительные комментарии, направленные на улучшение рукописи. Пожалуйста, отправьте исправленную рукопись, в которой эти комментарии учтены в достаточной степени, чтобы ее, возможно, не пришлось возвращать этому рецензенту.

Эта переработанная рукопись была существенно улучшена, а обсуждение стало более сбалансированным и информативным. Все мои основные проблемы были адекватно решены, за исключением одного пункта, модели на рис. 5 — приложение к рисунку 4.Сама фигура сбивает с толку / неясна, и я не понимаю основы построения модели так, как они это сделали. Конкретные опасения по поводу этой цифры следующие:

1) Какова ось Y на верхней панели «А»? Это должно быть отмечено. Я предполагаю, что это некоторая мера «плотности FG-Nup» — существуют ли какие-либо соответствующие единицы измерения?

Мы приносим свои извинения за то, что это было упущено из виду. Соответствующими единицами являются объемные доли. Мы перерисовали диаграмму на рис. 5 — дополнение к рисунку 4 и включили эту информацию.

2) Размеры L1 и L0 не соответствуют значениям в заголовке. Следовательно, схема вводит в заблуждение. Греческая буква не соответствует подписи. Преддверная область не обозначена.

Мы искренне извиняемся за путаницу и позаботились о том, чтобы в текущей версии маркировка и значения l1 и l0 согласовывались по всему тексту и заголовкам. Мы также перерисовали диаграмму на рис. 5 — дополнение к рисунку 4, чтобы шрифты ϕ везде соответствовали друг другу, и четко обозначили область вестибюля.

3) Непонятно, почему переходная область (L1) включена между преддверием и L0. Сравнивая верхнюю и нижнюю панели на А, видно, что преддверие эквивалентно цитоплазме. Это не имеет смысла.

Приносим извинения за путаницу. «Вестибюль» действительно представляет собой облако низкой плотности зародышей FG, которое простирается в цитоплазму за пределы области каркаса NPC. В этом смысле его действительно можно рассматривать как вариант «вестибулярной» области Tu et al., (2013) и/или «захват» области Lowe et al., (2015). Область промежуточной плотности l1 — это просто переходная область между вестибюлем и областью барьера высокой плотности внутри NPC. Мы отредактировали рисунок и основной текст, чтобы более четко объяснить эти вопросы. См. также ответ на следующий комментарий.

4) Для L1 = 30 нм и L0 = 5 нм первое впечатление, что ворота барьера смещены в сторону нуклеоплазмы. Это намерение? Такая модель согласовывалась бы с гипотезой о нуклеоплазматических воротах, выдвинутой группой Вейса, и, если это так, ее следует упомянуть.В качестве альтернативы, как цитоплазматическая, так и нуклеоплазматическая области L1 имеют размер 30 нм? Это поместит барьер в центр, но очень узкий. Нет особого смысла в том, чтобы «переходная область» была в 6 раз шире основного барьера, поэтому здесь необходимо некоторое обсуждение.

Еще раз приносим свои извинения за путаницу в значениях l1 и l0 на рисунке, которая теперь исправлена. l0=30 нм – центральная «барьерная» область высокой плотности, а l1=5 нм – переходная область промежуточной плотности.По обе стороны от центрального барьера (область l0) есть две «периферийные» области l1, поэтому барьер не смещен и расположен в центре NPC.

5) Неясно, почему ΔG для области L1 существенно меняется для разных вирусных частиц, тогда как ΔG для области L0 меняется минимально. Кажется, что ΔG для более плотной среды FG nup будет более чувствительна к размеру частиц. Более старая гипотеза предполагала плотные облака на нуклеоплазматической и цитоплазматической сторонах, но значительно меньшую плотность в центре.Здесь это рассматривается?

Отличный вопрос. Согласно модельному анализу, стоимость введения в центральную «барьерную» область относительно одинакова для всех размеров капсида. Напротив, они более изменчивы в области l1. Это основная причина, по которой значения ΔG в области l0 более похожи между капсидами разного размера, чем в области l1.

Одно из возможных механистических объяснений заключается в том, что стоимость внедрения в плотную область l0, вероятно, уже близка к насыщению даже для самого маленького капсида, в то время как в менее плотной области l1 разница между капсидами более заметна. Однако подчеркнем, что модель, изображенная на рисунке 5 — дополнении к рисунку 4, является лишь одной из возможных моделей NPC, основанных на ранее предложенных и согласующихся с ними. Полное рассмотрение различных моделей и вывод фактического распределения плотности зародышей FG внутри NPC выходит за рамки настоящей статьи и будет изучено в будущих работах.

6) Авторы правы в своем опровержении, что только часть NPC должна содержать область, в которой свободная энергия взаимодействия отрицательна, чтобы согласовываться с экспериментальным наблюдением римминга.Однако ни одна из областей, показанных на рисунке 5 — дополнение к рисунку 4, не имеет отрицательного значения ΔG. Есть заштрихованная область, которая, по-видимому, имеет отрицательную свободную энергию, но что это такое, остается неясным (точка 3), и неясно, включена ли эта энергия каким-либо образом в их соответствие данным.

Мы благодарим рецензента за этот комментарий. Действительно, свободная энергия в «вестибюле», показанном пунктирной линией, отрицательна и ответственна за наблюдаемую «окантовку». Мы изменили нашу схему и описания в основном тексте и подписи к рисунку, чтобы прояснить этот вопрос.

7) На нижней панели B аппроксимация зеленой кривой очень плохо аппроксимирует данные, но гораздо лучше на верхней панели. Кажется, здесь что-то не так.

Мы благодарим рецензента за это замечание. Это действительно была оплошность с нашей стороны, когда значения параметра aRan были перепутаны между нижней и верхней панелями. Приносим искренние извинения за ошибку и исправили цифру; качество подгонки на обеих панелях теперь одинаковое.

https://doi.org/10.7554/eLife.55963.sa2

Почему сейчас высокие фрахтовые ставки и как грузоотправителям адаптироваться?

Рост фрахтовых ставок и нехватка контейнеров стали глобальной проблемой, нарушающей цепочки поставок в разных отраслях. За последние шесть-восемь месяцев фрахтовые ставки по транспортным каналам взлетели до небес. Это оказало косвенное влияние на смежные функции и отрасли, такие как автомобилестроение, производство и другие.

Чтобы смягчить стремительное воздействие, необходимо тщательно изучить основные причины абсурдного роста цен на перевозки во всем мире

Пандемия COVID-19

Судоходная отрасль стала одним из секторов, наиболее пострадавших от пандемии Covid-19.Во-первых, все основные нефтедобывающие страны резко сократили добычу из-за пандемии, которая создала дисбаланс между спросом и предложением, что привело к ценовому давлению. Если до недавнего времени цены на сырую нефть колебались в районе 35 долларов США за баррель, то в настоящее время они превышают 55 долларов США за баррель.

Во-вторых, растущий спрос на товары и нехватка порожних контейнеров являются еще одной причиной того, что дистрибуция выходит из строя, что, в свою очередь, привело к столь значительному росту фрахтовых ставок.В связи с остановкой производства в первой половине 2020 года из-за пандемии компаниям пришлось наращивать производство, чтобы удовлетворить невероятно высокие требования. Кроме того, из-за ограничений, связанных с пандемией, которые нарушили работу авиационной отрасли, на морские перевозки возникла огромная нагрузка по доставке товаров. Это, в свою очередь, повлияло на время оборота контейнеров.

Постоянная зависимость от разделенных поставок

Розничные продавцы электронной коммерции в течение многих лет всесторонне используют разделенные поставки по нескольким причинам.Во-первых, товары должны быть собраны из запасов в разных местах. Во-вторых, разбивка заказа на подзаказы, особенно если он относится к разным категориям, может помочь увеличить скорость доставки. В-третьих, если в одном грузовике или самолете недостаточно места для всей партии груза, ее, возможно, придется разделить на отдельные ящики и транспортировать отдельно. Раздельные поставки происходят в больших масштабах во время междугородних или международных перевозок товаров.

Кроме того, клиенты, которым требуется отправить товары в несколько мест, также могут поощрять раздельные поставки. Чем больше отгрузок, тем выше стоимость доставки, поэтому эта тенденция оказывается дорогостоящей и часто вредной для экосистемы.

Brexit увеличивает фрахтовые ставки на товары в Великобританию и из Великобритании

Помимо пандемии, Brexit вызвал много трансграничных трений, из-за которых стоимость доставки товаров в страну и из страны непомерно выросла. С Brexit Великобритании пришлось отказаться от нескольких субсидий, которыми она пользовалась под эгидой ЕС. С учетом того, что пересылка товаров в Великобританию и из Великобритании теперь рассматривается как межконтинентальная перевозка, в сочетании с пандемией, усложняющей цепочки поставок, фрахтовые ставки на товары в Великобританию и из Великобритании уже выросли в четыре раза.
Кроме того, трения на границе также побудили судоходные компании отказаться от ранее согласованных контрактов, что снова означало, что компании, пытающиеся перевозить товары, были вынуждены платить повышенные спотовые ставки.

Глобальные фрахтовые ставки еще больше выросли из-за этого события.

Отгрузка Импорт из Китая

Помимо вышеперечисленных причин, еще одной важной причиной резкого роста цен является огромный спрос на контейнеры в Китае.Китай, являющийся крупнейшим производителем в мире, имеет огромную зависимость западных стран, таких как США и Европа, от Китая в отношении различных товаров. Поэтому страны готовы удвоить или утроить цену, чтобы закупать товары в Китае. Таким образом, хотя наличие контейнеров в любом случае резко сократилось из-за пандемии, в Китае существует огромный спрос на контейнеры, и фрахтовые ставки там также значительно высоки. Это также в значительной степени повлияло на рост цен.

Другие факторы в текущем сценарии

Помимо вышеупомянутых пунктов, есть несколько менее известных факторов, влияющих на высокие фрахтовые ставки.Проблемы со связью, возникающие из-за отклонений или отмен рейсов в последнюю минуту в текущем сценарии, являются одной из причин стремительного роста цен на фрахт. Кроме того, транспортный сектор, как и другие отрасли, имеет тенденцию иметь волновой эффект, когда корпорации предпринимают серьезные действия. Таким образом, когда лидеры рынка (крупнейшие перевозчики) решают увеличить свои расходы, чтобы возместить убытки, общие рыночные ставки также раздуваются.

Промышленность может прибегнуть к нескольким мерам, чтобы остановить рост фрахтовых ставок.Изменение дня или времени отгрузки и транспортировка в более «спокойные» дни, такие как понедельник или пятница, вместо четверга, который обычно считается самым загруженным, может снизить расходы на фрахт на 15–20% в год.

Компании могут заранее планировать объединение и отправку нескольких доставок одновременно вместо отдельных доставок. Это может помочь компаниям воспользоваться скидками и другими стимулами от транспортных компаний при оптовых поставках. Чрезмерная упаковка может увеличить общую стоимость доставки, а также нанести ущерб экосистеме в целом.Поэтому компаниям следует избегать этого. Кроме того, небольшим компаниям следует обращаться за услугами к партнерам по комплексным перевозкам, поскольку аутсорсинг может помочь им сосредоточиться на своих основных операциях.

Что можно сделать, чтобы противостоять росту фрахтовых ставок?

Предварительное планирование

Одним из наиболее эффективных способов борьбы с высокими фрахтовыми ставками является заблаговременное планирование отгрузок. Стоимость грузов растет с каждым днем.Чтобы избежать чрезмерных расходов и воспользоваться услугами раннего бронирования, компании должны стратегически планировать свои поставки заблаговременно. Это может помочь им значительно сэкономить и избежать задержек. Использование цифровых платформ для использования исторических данных о стоимости фрахта для прогнозирования ставок, а также тенденций, влияющих на ставки, также пригодится при предварительном планировании отгрузки.

Обеспечение прозрачности

Именно цифровизация может привести к стратегической трансформации отрасли морских перевозок и логистики. В настоящее время игрокам экосистемы крайне не хватает видимости и прозрачности. Таким образом, переосмысление процессов, оцифровка общих операций и внедрение технологий для совместной работы могут максимально повысить эффективность и снизить торговые издержки. Помимо повышения устойчивости цепочек поставок, это поможет отрасли опираться на информацию, основанную на данных, тем самым помогая игрокам принимать обоснованные решения. Поэтому отрасли необходимо адаптироваться технологически, что приведет к системным изменениям в том, как она работает и торгует.
Источник: CNBC TV18

.