Главная
Наша история
За время, прошеднее с момента образования, компания стала лидером по внедрению инноваций в городском электрическом транспорте
2013
Год основания компании. Cоздана и запатентована уникальная поворотная, эластичная и 100%-низкопольная трамвайная тележка, не имеющая аналогов в мире.
2014
Открыт тележечный цех в Твери. Состоялась презентация уникальной тележки на выставке «Электротранс-2014» в Москве.
Выпущены 100%-низкопольные односекционный трамвай City Star и трёхсекционный трамвай «Витязь», а также — первый продукт в сегменте колесного электротранспорта — низкопольный троллейбус «Адмирал».
2016
Компания заключила самый большой в мире контракт на поставку в Москву 300 вагонов «Витязь М» за 3 года. Создан трамвайный вагон City Star с европейской колеей 1435 мм.
2016В рамках «Иннопром-2016» презентованы 2 новые модели – низкопольный, трёхсекционный трамвай «Варяг», а также флагман линейки трамвайных вагонов компании «Витязь — М».
2017
Для поставки в Санкт-Петербург выпущен низкопольный двухсекционный трамвайный вагон «Богатырь».
2018
2018
Начала работу вторая производственная площадка компании – «Невский завод электрического транспорта». Презентация инновационного односекционного трамвайного вагона «Львёнок».
2019
Открытие после модернизации «Тверского механического завода электротранспорта» — предприятие полного цикла по созданию алюминиевых кузовов для городского электротранспорта
2019
Презентация уникальной тележки для колеи 1000 мм и модернизированного двухсекционного трамвая «Богатырь М»
2020
Презентация обновленной версии троллейбуса «Адмирал» на новой производственной площадке — «Энгельсском заводе электрического транспорта»
Сайты транспортных компаний.
Современные возможности
Современных заказчиков на сайтах транспортных компаний интересует, в первую очередь, география работы и стоимость услуг. Поскольку стоимость доставки складывается из многих параметров, лучше, чтобы информация о тарифах и всех попутных услугах была представлена на сайте и постоянно обновлялась. Когда заказчик знает, сколько он потратит средств на перевозку у той или иной компании, ему проще сделать выбор. Большинство транспортных компаний на сайтах выкладывают прайсы, где в таблицах указана стоимость доставки груза до каждого возможного пункта назначения в зависимости от размеров груза и вида транспорта. Однако работать с такими таблицами бывает очень неудобно, особенно если география компании очень обширна. Поэтому на некоторых сайтах транспортных компаний можно найти удобные калькуляторы, в которые вносится вся информация о перевозимом грузе и возможных дополнительных операциях с ним, и он сразу выдает полную стоимость перевозки. Также на многих сайтах компаний можно сделать он-лайн заявку на выполнение грузоперевозки.
Однако, помимо стоимости услуг, при выборе транспортной компании следует учитывать и другие параметры: её опыт работы, техническое оснащение (например, автомобильный парк), условия договора на перевозку, отзывы заказчиков и т.п.
Битрикс — Корпоративный сайт транспортной компании
Обсуждения (1)
Обсуждения (1 )
Установка
Уважаемые коллеги!Для корректной установки готового решения необходимо убедиться, что на Вашем хостинге используется версия PHP не ниже 7.3.
Также обязательным требованием является установка всех рекомендуемых на момент установки обновлений от «1С-Битрикс».
После соблюдения данных рекомендаций можно приступать к установке готового решения.
1. Загрузить решение из маркетплейса.
http://адрес_сайта/bitrix/admin/update_system_partner.php?addmodule=a1expert.
transport
После завершения загрузки появится кнопка «установить».
2. Установить сайт при помощи мастера на странице
Настройки—>Настройки продукта—>Список мастеров
Выберите мастер «Сайт транспортной компании» от разработчика А1 Интернет Эксперт, нажмите «установить» и следуйте шагам мастера.
3. Включите режим правки и редактируйте включаемые области и элементы инфоблоков прямо на главной странице сайта.
ВНИМАНИЕ!Перед установкой обновления ОБЯЗАТЕЛЬНО выполните полное резервное копирование сайта. Если вы вносили изменения в шаблон решения, то дополнительно скопируйте всю папку шаблона!
Поддержка
Поддержка решения осуществляется:По электронной почте: [email protected]
При каждом обращении в поддержку, обязательно указывайте:
Адрес сайта
Четкое описание проблемы, описание действий как вызвать проблему, по возможности скриншоты.
Выполнение данных условий значительно ускорит обработку Вашей заявки и сократит время её исполнения!
Техническая поддержка работает с понедельника по пятницу с 07:00 до 16:00 по Московскому времени.
Мы ценим ваше время и стараемся как можно быстрее отвечать на запросы. Время реагирования на запрос — от двух часов.
Наш сайт: https://a1-reklama.ru
Решаем вместе Есть предложения по организации учебного процесса или знаете, как сделать колледж лучше? Написать о проблеме 28.01.2022 28.01.2022 года ДНД Барс совместно с сотрудниками полиции ОП 4 УМВД России по городу Омску, в рамках ЦОПО Правопорядок, было проведено профилактическое мероприятие по предупреждению граждан о сохранности своему имущества, а так же профилактика фальшивомонетчества на торговых объектах, расположенных на территории ОП 4.  28.01.2022 Одной из самых героических и трагических страниц Великой Отечественной войны стала блокада Ленинграда. Кольцо окружения вокруг города сомкнулось 8 сентября 1941г. Завершилась блокада города — 27 января 1944 г., когда войска Ленинградского, Волховского и 2-го Прибалтийского фронтов отбросили немецкие войска от города, освободили практически всю Ленинградскую область.  ru 28.01.2022 Баскетбол отделений 27 января лучшие баскетболисты отделений колледжа соревновались в турнире по баскетболу, посвящённому приближающемуся Дню Защитника Отечества. Напряжённейшая борьба за победу шла в каждой игре до последних секунд. Подробнее… 27.01.2022 27 января – День воинской славы России
В этот день в нашей стране отмечается полное освобождение Ленинграда от фашистской блокады в 1944 году. Секретарь совета музея истории ОКТС Суворова В.А. Подробнее… 26.01.2022 27 января день снятия блокады с города Ленинграда, это и день воинской славы, и день горькой памяти об одной из самых страшных страниц великой войны.  ru 26.01.2022 Уважаемые студенты ОКТС!!! От всей души поздравляем Вас с Днём студента!!! Пусть в Вашей жизни будут только светлые, радостные, счастливые минуты! Преподаватели колледжа приготовили для Вас небольшой подарок! С праздником!!!! 25.01.2022 Студенчество-воистину лучший период жизни. Желаем Вам прочувствовать на себе все его прелести. Пусть учеба дается легко, экзамены сдаются быстро, а свободного времени будет все больше. Желаем Вам направлять весь присутствующий энтузиазм в нужное русло. Пока жизнь предоставляет вам все возможности, берите от нее все. Пусть годы, что пролетают так быстро, оставят в вашей памяти неизгладимый след радостных и положительных впечатлений! С днем студента!!! 21.01.2022 Наши теннисисты лучшие! 20 января в спортивном зале Омского Техникума Железнодорожного Транспорта состоялся командный открытый турнир среди студентов СПО по настольному теннису. Подробнее… 21.01.22 Волейбол к Дню студента Сборная команда ОКТС по волейболу принимала участие в соревнованиях, посвященных Дню студента. В упорной борьбе с командой аграрного колледжа, заняли 2 место. Состав команды: Цугалов Арсен- капитан (гр.Д-31),Буробин Данила, Буробин Михаил (гр.Д-33), Вениченко Руслан (гр.Д-29), Скирденко Максим (гр.З-76), Жазыбаев Амальгельды (гр.С-61), Парфенов Илья (гр.Д-31), Харитонов Артем (гр.Д-30). Всем здоровья и успехов в учебе и спорте! Подробнее… |
Запущен официальный сайт департамента транспорта и дорожного хозяйства Краснодара :: Krd.ru
Разработчики презентовали сайт во время городского совета по дорожном хозяйству и транспорту.
С помощью этой платформы жители смогут в режиме онлайн узнавать о последних изменениях в части дорожной, транспортной и пешеходной инфраструктур, направить электронное обращение, а также ознакомиться с проектами, которые планируют или уже реализуют на территории краевого центра.
— Одна из важнейших функций этой платформы — возможность получать обратную связь от жителей города. Кроме того, теперь краснодарцы смогут ознакомиться с самой актуальной дорожной информацией в один клик. Безусловно, контент в каждом разделе будем обновлять регулярно. При необходимости сайт доработаем с учетом пожеланий жителей, — прокомментировал заместитель главы города Артём Доронин.
Официальный сайт департамента транспорта и дорожного хозяйства заработал по адресу dtkrd.ru.
На сайте опубликованы актуальные проекты, их цели и задачи, а также планы по реализации. Как рассказал разработчик, руководитель креативного агентства Doodah Studio Никита Сычев, в основе концепции раздела «О проектах» — цветовые маркеры:
- зелёный цвет — «Город для людей»;
- красный цвет — «Общественный транспорт»;
- синий цвет — «Дорожная инфраструктура».
Планируется, что этими цветами будут отмечены в том числе новости, чтобы пользователю было удобно ориентироваться в информационной повестке.
В разделе «Пресс-центр» будут размещать актуальные новости, регулярно обновлять фото- и видеогалереи.
«Общественные вопросы» — раздел, где размещена электронная форма, с помощью которой жители смогут в один клик оставить обращение. Также в нём опубликована программа дорожных работ и опросы на актуальные темы.
В разделе «Контакты» указана структура департамента транспорта и дорожного хозяйства с контактной информацией, а также актуальные нормативные документы.
В дальнейшем разработчики планируют разместить на сайте раздел с интерактивными картами, включая схемы движения городских маршрутов.
Транспортные услуги от RAIDEN
RaidenBot — это Ваш личный виртуальный помощник на сайте raiden.ru.
Когда Вы приходите на сайт, он приветствует Вас и терпеливо ждет начала диалога.
Если Вы
предпочитаете классический метод навигации по сайту, то Вы можете использовать меню,
которое расположено слева от чата. Вся информация, которая есть на сайте доступна в
пределах этого меню.
Компания Raiden оказывает так много услуг в сфере транспортного обслуживания, что разобраться в их разнообразии может быть непросто. Вот здесь и приходит на помощь RaidenBot.
Вы можете задать боту вопрос в свободной форме через поле для ввода, которое расположено
внизу под диалогом, и он подберет для Вас наиболее релевантную страницу сайта. Либо Вы
можете следовать его подсказкам, выбирая на каждом этапе диалога один из предложенных
вариантов ответа. Если ни один из предложенных вариантов Вам не подходит, можете также
ответить в свободной форме через поле для ввода внизу.
Если RaidenBot решил, что нашел подходящую для Вас страницу, он сам ее вызовет, а после того, как Вы с ней ознакомитесь, предложит продолжить диалог или связаться с менеджером. Кроме того, если в ходе диалога, бот понимает, что Вас интересует определенный раздел сайта, он активирует этот раздел в меню слева.
Иногда RaidenBot может запутаться и перестать Вас понимать, в таком случае он предложит Вам связаться с менеджером или повторить вопрос.
RaidenBot помнит, о чем Вы с ним говорили при последней встрече и будет всегда предлагать продолжить с того места, где Вы остановились.
В любой момент во время диалога Вы можете вернуться к его началу, просто набрав команду
«в начало» или щелкнув по логотипу Raiden.
Будьте внимательны, если RaidenBot спрашивает
у Вас что-то конкретное, например, Ваше имя, то команду он может не понять, решив, что
«в начало» это и есть ваше имя.
Если Вы хотите связаться с менеджером, попросите об этом бота, набрав, например, «менеджер» или «свяжитесь со мной». Вы можете выбрать удобный Вам способ связи. Если Вы предпочитаете общение по телефону, то менеджер перезвонит Вам сразу же. Если Вам удобнее общаться по электронной почте, то можете передать Ваш вопрос боту, он адресует его менеджеру, и Вам ответят в ближайшее время.
Если Вам необходимо повторно вызвать эту справку, наберите «помощь» или просто вопросительный знак.
Сведения о показателях состояния безопасности дорожного движения
Сведения о показателях состояния безопасности дорожного движения
Уважаемые посетители сайта! В связи с проведением технических работ показатели аварийности на территории Российской Федерации доступны в основных разделах за 2021 год,
а также за период 2004-2014 гг.
в виде архива в разделе «Выгрузка показателей БДД».
Сведения за период 2015-2020 гг. станут доступны после завершения работ.
Показатели
ПРИМЕНИТЬ
Выберите не более 5 показателей
Переход к районам Сравнение регионов
Сравнение территорий
- ДТП
- Погибло
- Ранено
- Регионы
- Дороги
Дороги , которые проходят через регион:
Регионы , через которые проходит дорога:
| ДТП | 0 | 0 | 0 | ||
| Погибло | 0 | 0 | 0 | ||
| Ранено | 0 | 0 | 0 |
| СУБЪЕКТ | ДТП | ПОГИБЛО | РАНЕНО |
Уважаемые посетители, обращаем ваше внимание, раздел «Места концентрации ДТП» работает в тестовом режиме!
Значение дороги
| МЕСТ КОНЦЕНТРАЦИИ | ДТП | ПОГИБЛО | РАНЕНО | |
| Российская Федерация | 2451 | 225 | 2943 | 2943 |
|
Погибло Ранено |
| Тип | Дата формирования | ||
| Место | в населённом пункте | ||
| Значение дороги | |||
| Количество ДТП | Погибло | Ранено |
| Дата, потери |
Вид и место происшествия |
|---|
|
||
|
|
Электрокатализатор Fe–N–C с плотными активными центрами и эффективным массопереносом для высокопроизводительных топливных элементов с протонообменной мембраной
Дебе, М. К. Электрокатализатор: подходы и проблемы для автомобильных топливных элементов. Природа 486 , 43–51 (2012).
КАС Статья Google Scholar
Шао М., Чанг К., Доделет Ж.-П. и Чениц, Р. Последние достижения в области электрокатализаторов для реакции восстановления кислорода. Хим. Ред. 116 , 3594–3657 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Wu, G., More, K.L., Johnston, C.M. & Zelenay, P. Высокоэффективные электрокатализаторы для восстановления кислорода, полученные из полианилина, железа и кобальта. Наука 332 , 443–447 (2011).
КАС Статья Google Scholar
Гастайгер, Х. А., Коча, С. С., Сомпалли, Б. и Вагнер, Ф. Т. Контрольные показатели активности и требования к платиновым, платиновым и неплатиновым катализаторам восстановления кислорода для ПОМТЭ.
Заяв. Катал. B 56 , 9–35 (2005).
КАС Статья Google Scholar
Chen, C. et al. Высококристаллические мультиметаллические нанокаркасы с трехмерными электрокаталитическими поверхностями. Наука 343 , 1339–1343 (2014).
КАС Статья Google Scholar
Биан, Т. и др. Эпитаксиальный рост сдвоенных звездообразных декаэдров Au-Pt ядро-оболочка в качестве высокопрочных электрокатализаторов. Нано Летт. 15 , 7808–7815 (2015).
КАС Статья Google Scholar
Чжан, Л., Уилкинсон, Д. П., Лю, Ю. и Чжан, Дж. Прогресс в области наноструктурированных (Fe или Co)/N/C электрокатализаторов из неблагородных металлов для реакции восстановления кислорода в топливных элементах. Электрохим. Acta 262 , 326–336 (2018).
Артикул Google Scholar
Xia, B.Y. et al. Бифункциональный кислородный электрокатализатор на основе металлоорганического каркаса. Нац. Энергия 1 , 15006 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Zheng, Y. et al. Молекулярный уровень g-C 3 N 4 координированные переходные металлы как новый класс электрокатализаторов для реакций кислородного электрода. Дж. Ам. хим. соц. 139 , 3336–3339 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Wang, J. et al. Дизайн N-координированных двухметаллических центров: стабильный и активный катализатор, не содержащий платины, для кислой реакции восстановления кислорода. Дж. Ам. хим. соц. 139 , 17281–17284 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Стриклэнд, К. и др. Высокоактивный электрокатализатор на основе металлов неплатиновой группы восстановления кислорода без прямой координации металл-азот.
Нац. коммун. 6 , 7343 (2015).
КАС Статья Google Scholar
Многолетний план исследований, разработок и демонстраций (Министерство энергетики США, Управление технологий топливных элементов, 2017 г.).
Сингх, К., Размджуи, Ф. и Ю, Дж.-С. Активные центры и факторы, влияющие на них для эффективной реакции восстановления кислорода в координированных металл-N пиролизных и непиролизных катализаторах: обзор. Дж. Матер. хим. А 5 , 20095–20119 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Крамм, Ю. И., Лефевр, М., Ларуш, Н., Шмайссер, Д. и Доделе, Ж.-П. Корреляции между массовой активностью и физико-химическими свойствами катализаторов Fe/N/C для ОВР в топливных элементах с ПОМ с помощью 57 Fe Мессбауэровской спектроскопии и других методов. Дж. Ам.
хим. соц. 136 , 978–985 (2014).
КАС Статья Google Scholar
Zitolo, A. et al. Идентификация каталитических центров восстановления кислорода в графеновых материалах, легированных железом и азотом. Нац. Матер. 14 , 937–942 (2015).
КАС Статья Google Scholar
Сахрайе, Н.Р.и другие. Количественная оценка плотности и использования активных центров в катализаторах электровосстановления кислорода из неблагородных металлов. Нац. коммун. 6 , 8618 (2015).
КАС Статья Google Scholar
Li, J. et al. Структурно-механистическая основа высокой активности катализаторов Fe–N–C по отношению к восстановлению кислорода. Энергетика Окружающая среда. науч. 9 , 2418–2432 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Цзя, К. и др. Спектроскопическое понимание природы активных центров в железо-азотно-углеродных электрокатализаторах восстановления кислорода в кислоте. Nano Energy 29 , 65–82 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Chen, Y. et al. Изолированные одиночные атомы железа, закрепленные на пористом углероде, легированном азотом, как эффективный электрокатализатор для реакции восстановления кислорода. Анжю. хим. Междунар. Эд. 56 , 6937–6941 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Fei, H. et al. Общий синтез и окончательная структурная идентификация одноатомных катализаторов MN 4 C 4 с регулируемой электрокаталитической активностью. Нац. Катал. 1 , 63–72 (2018).
Артикул Google Scholar
Zhang, H. et al.
Катализаторы одноатомного железа для восстановления кислорода в кислых средах: контроль размера частиц и термическая активация. Дж. Ам. хим. соц. 139 , 14143–14149 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Chen, X., Yu, L., Wang, S., Deng, D. & Bao, X. Высокоактивный и стабильный одиночный участок железа в графеновых нанолистах для реакции восстановления кислорода. Nano Energy 32 , 353–358 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Liu, Q., Liu, X., Zheng, L. & Shui, J. Твердофазный синтез электрокатализатора Fe–N–C для мощных топливных элементов с протонообменной мембраной. Анжю. хим. Междунар. Эд. 57 , 1204–1208 (2018).
КАС Статья Google Scholar
Wan, X. et al. Синтез и идентификация активных центров одноатомных катализаторов Fe-N-C для реакции восстановления кислорода.
ChemElectroChem 6 , 304–315 (2019).
КАС Статья Google Scholar
Жауэн Ф., Лефевр М., Доделе Ж.-П. & Cai, M. Термообработанные катализаторы Fe/N/C для электровосстановления O 2 : находятся ли активные центры в микропорах? J. Phys. хим. B 110 , 5553–5558 (2006).
КАС Статья Google Scholar
Ye, Y. et al. Функционализация поверхности ZIF-8 с помощью цитрата железа и аммония в сторону сильного воздействия активных центров Fe-N для эффективного электровосстановления кислорода и углекислого газа. Nano Energy 38 , 281–289 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Fu, X. et al. Полимерная графенизация in situ с нанопористостью в азотсодержащем электрокатализаторе повышает производительность топливных элементов с полимерно-электролитной мембраной.
Доп. Матер. 29 , 1700363 (2017).
Google Scholar
Пампель, Дж. и Феллингер, Т.-П. Открытие узких мест для улучшения углеродных электрокатализаторов, легированных азотом. Доп. Энергия Матер. 6 , 1502389 (2016).
Артикул Google Scholar
Малько, Д., Куцернак, А. и Лопес, Т. In situ Электрохимический количественный анализ активных центров в катализаторах Fe–N/C из неблагородных металлов. Нац. коммун. 7 , 13285 (2016).
КАС Статья Google Scholar
О’Хейр, Р., Барнетт, Д. М. и Принц, Ф. Б. Граница трех фаз: математическая модель и экспериментальные исследования для топливных элементов. Дж. Электрохим. соц. 152 , А439 (2005).
Артикул Google Scholar
Seh, Z.W. et al. Сочетание теории и эксперимента в электрокатализе: понимание дизайна материалов. Наука 355 , eaad4998 (2017).
Артикул Google Scholar
Proietti, E. et al. Катодный катализатор на основе железа с повышенной удельной мощностью в топливных элементах с мембраной из полимерного электролита. Нац. коммун. 2 , 416 (2011).
Артикул Google Scholar
Antonacci, P. et al. Баланс сопротивления массопереносу и сопротивления мембраны при подборе толщины микропористого слоя для топливных элементов с мембраной из полимерного электролита, работающих при высоких плотностях тока. Электрохим. Acta 188 , 888–897 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Chenitz, R. et al. Специфическое деметаллирование каталитических центров Fe–N 4 в микропорах NC_Ar + NH 3 лежит в основе начальной потери активности высокоактивного катализатора Fe/N/C, используемого для восстановления кислорода в ПОМ-топливе.
клетки. Энергетика Окружающая среда. науч. 11 , 365–382 (2018).
КАС Статья Google Scholar
Zeng, X. et al. Одноатомная прививка Pt 1 на Fe–N 4 в центре: Pt 1 @Fe–N–C многофункциональный электрокатализатор со значительно улучшенными свойствами. Доп. Энергия Матер. 8 , 1701345 (2018).
Артикул Google Scholar
Шарретер, Ф., Ruggeri, S., Jaouen, F. & Dodelet, J.P. Повышение активности катализаторов Fe/N/C в катодах топливных элементов PEM с использованием сажи с высоким содержанием неупорядоченного углерода. Электрохим. Acta 53 , 6881–6889 (2008 г.).
КАС Статья Google Scholar
Лефевр М., Пройетти Э., Жауэн Ф. и Доделе Ж.-П. Катализаторы на основе железа с повышенной активностью восстановления кислорода в топливных элементах с полимерным электролитом.
Наука 324 , 71–74 (2009).
Артикул Google Scholar
Meng, H. et al. Катодные катализаторы на основе порфирина железа для топливных элементов с мембраной из полимерного электролита: влияние смесей NH 3 и Ar в качестве пиролизных газов на каталитическую активность и стабильность. Электрохим. Acta 55 , 6450–6461 (2010 г.).
КАС Статья Google Scholar
Жауэн, Ф. и др. Сравнение активности восстановления кислорода в топливных элементах с вращающимся электродом и протонообменной мембраной для высокоактивных катализаторов Fe–N–C. Электрохим. Acta 87 , 619–628 (2013).
КАС Статья Google Scholar
Афсахи Ф. и Калиагин С. Неблагородные электрокатализаторы, синтезированные на металлоорганических каркасах. Дж.
Матер. хим. А 2 , 12270 (2014).
КАС Статья Google Scholar
Zhu, Q.-L., Xia, W., Akita, T., Zou, R. & Xu, Q. Металлоорганические каркасные сотовые открытые пористые наноструктуры в виде драгоценных металлов. свободные катализаторы для высокоэффективного электровосстановления кислорода. Доп. Матер. 28 , 6391–6398 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Шуй Дж., Чен, К., Грабстанович, Л., Чжао, Д. и Лю, Д.-Дж. Высокоэффективный катализатор из неблагородных металлов, изготовленный с металлоорганическим каркасом в непрерывной углеродной нановолокнистой сетке. Проц. Натл акад. науч. США 112 , 10629–10634 (2015).
КАС Статья Google Scholar
Армель В. и др. Структурные дескрипторы цеолитно-имидазолатных каркасов являются ключом к активности катализаторов Fe-N-C.
Дж. Ам. хим. соц. 139 , 453–464 (2016).
Артикул Google Scholar
Zhou, B. et al. Высокоэффективные электрокатализаторы восстановления кислорода на основе пористого органического полимера на основе ферроцена. Дж. Матер. хим. А 5 , 22163–22169 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Zhao, D. et al. Высокоэффективные электрокатализаторы из неблагородных металлов, полученные из однореакторных синтезированных цеолито-имидазолатных каркасов. Доп. Матер. 26 , 1093–1097 (2014).
КАС Статья Google Scholar
Tian, J. et al. Оптимизированный синтез катодных катализаторов Fe/N/C для топливных элементов с ПОМ: вопрос силы координации железо-лиганд. Анжю. хим. Междунар. Эд. 52 , 6867–6870 (2013).
КАС Статья Google Scholar
Чжао Д.и другие. Каркас имидазолата железа в качестве предшественника электрокатализаторов в топливных элементах с мембраной из полимерного электролита. Хим. науч. 3 , 3200–3205 (2012).
КАС Статья Google Scholar
Юань, С. и др. Высокоактивный и не содержащий носителя катализатор восстановления кислорода, изготовленный из пористого полипорфирина со сверхвысокой площадью поверхности. Анжю. хим. Междунар. Эд. 52 , 8349–8533 (2013).
КАС Статья Google Scholar
Chung, H.T. et al. Прямое понимание на атомном уровне активных центров высокоэффективного катализатора ORR, не содержащего МПГ. Наука 357 , 479–484 (2017).
КАС Статья Google Scholar
Wang, X. X. et al. Координированные азотом катализаторы с одним атомом кобальта для восстановления кислорода в топливных элементах с протонообменной мембраной.
Доп. Матер. 30 , 1706758 (2018).
Артикул Google Scholar
He, Y. et al. Высокоактивные атомарно-дисперсные катодные катализаторы CoN 4 для топливных элементов, полученные из MOF с поверхностно-активным веществом: стратегия удержания углеродной оболочки. Энергетика Окружающая среда. наука . 12 , 250–260 (2019).
Li, J. et al. Атомно-дисперсные марганцевые катализаторы восстановления кислорода в топливных элементах с протонообменной мембраной. Нац. Катал. 1 , 935–945 (2018).
Артикул Google Scholar
Шан, Л. и др. Хорошо диспергированные углеродные нанокаркасы, полученные из ZIF, легированные Co, N, посредством прокаливания, защищенного мезопористым кремнеземом, в качестве эффективных электрокатализаторов восстановления кислорода. Доп. Матер. 28 , 1668–1674 (2016).
КАС Статья Google Scholar
Гор, Г.Ю., Томмес, М., Цихош, К.А. и Неймарк, А.В. Метод теории функционала плотности закаленного твердого тела для определения характеристик мезопористого углерода по адсорбции азота. Carbon 50 , 1583–1590 (2012).
КАС Статья Google Scholar
Newville, M. IFEFFIT: интерактивный анализ XAFS и подгонка FEFF. J. Синхротронное излучение. 8 , 322–324 (2001).
КАС Статья Google Scholar
Равель Б. и Ньювилл М. АФИНА, АРТЕМИДА, ГЕФЕСТ: анализ данных рентгеновской абсорбционной спектроскопии с использованием IFEFFIT. J. Синхротронное излучение. 12 , 537–541 (2005).
КАС Статья Google Scholar
| ||
Механизм Cu+-транспортирующих АТФаз: Растворимые шапероны Cu+ непосредственно переносят Cu+ к трансмембранным транспортным сайтам
Abstract
Как и в других АТФазах P-типа, связывание металлов с трансмембранными сайтами связывания металлов (TM-MBS) в Cu + -АТФаза необходима для фосфорилирования ферментов и последующего транспорта.
Однако Cu + не имеет доступа к Cu + -АТФазам в свободной (гидратированной) форме, а связан с белком-шапероном. Был описан перенос Cu + от шаперонов Cu + к регуляторным цитоплазматическим металлосвязывающим доменам (MBD), присутствующим в этих АТФазах, но нет никаких доказательств предполагаемого последующего перемещения Cu + от MBD к TM- МБС. В качестве альтернативы мы постулируем экономный перенос Cu + шапероном непосредственно в TM-MBS.При тестировании обеих моделей была изучена доставка Cu + с помощью Archaeoglobus fulgidus Cu + шаперона CopZ к соответствующей Cu + -АТФазе, CopA. Как и ожидалось, CopZ взаимодействовал с MBD CopA и доставлял металл. Cu + -нагруженные MBD, действующие как доноры металлов, были неспособны активировать CopA или укороченный CopA без MBD. Наоборот, CopZ, нагруженный Cu + , активировал конструкции CopA ATPase и CopA, в которых MBD были неспособны связывать Cu + .
Кроме того, в условиях отсутствия оборота CopZ перенесла Cu + в TM-MBS CopA, в котором отсутствуют MBD. Эти данные согласуются с моделью, в которой MBD выполняют регуляторную функцию, не участвуя в транспорте металлов, а шаперон доставляет Cu + непосредственно в сайты трансмембранного транспорта Cu + -АТФаз.
Медь является важным кофактором во многих биологических процессах (1). Однако он также участвует во вредных реакциях Фентона. Следовательно, Cu «забуферен» на уровне «без свободной Cu» металлотионеинами и шаперонами с константами связывания Cu + в пикомолярно-фемтомолярном диапазоне (2, 3).В рамках этих ограничений шапероны Cu + направляют Cu + к различным внутриклеточным мишеням, а трансмембранные транспортные системы Cu + поддерживают общую квоту меди в диапазоне 10–100 мкМ (1⇓⇓–4). То, как шапероны Cu + переносят металл в места трансмембранного транспорта и обратно, является центральной особенностью трансмембранного транспорта Cu + .
Чтобы лучше понять эти явления, мы изучили доставку Cu + шапероном Archaeoglobus fulgidus Cu + , CopZ, к соответствующей Cu + -АТФазе, CopA.
CopA является членом подгруппы P 1B АТФаз P-типа (5⇓–7). Cu + -АТФазы необходимы для поддержания гомеостаза Cu + . Например, мутации в двух генах Cu + -ATPase, присутствующих у людей, ATP7A и ATP7B, приводят к синдрому Менкеса и болезни Вильсона соответственно (8, 9). Транспортный цикл Cu + -АТФаз следует классической модели Альберса-Поста E1/E2 (10⇓-12). Каталитическое фосфорилирование фермента в конформации E1 происходит при связывании цитоплазматического металла с трансмембранными сайтами связывания металлов (TM-MBS) и связывании АТФ с высокой аффинностью (1 мкМ) с АТФ-связывающим доменом (АТФ-BD) (рис.1). Предполагается, что при фосфорилировании Cu + окклюзируется внутри трансмембранной области. Последующее конформационное изменение делает возможной деокклюзию металла и его высвобождение во внеклеточный (везикулярный/люминальный) компартмент с последующим ферментативным дефосфорилированием и возвращением к форме E1 (10).
Функциональные исследования различных Cu + -АТФаз охарактеризовали транспорт Cu + , Cu + -зависимую АТФазную активность, парциальные реакции фосфорилирования и дефосфорилирования (5, 13⇓⇓⇓⇓⇓–19).
Схема структур CopA и CopZ и гипотетические модели доставки Cu + в ТМ-МБС. Топологическая схема CopA включает структуры A-домена [идентификационный код банка данных белков (PDB) 2HC8] и ATP-BD (идентификационный код PDB 2B8E). Структуры N-MBD и C-MBD представляют собой модели гомологии, основанные на четвертом N-MBD белка Menkes (идентификационный код PDB 1AW0) и Bacillus subtilis CopZ (идентификационный код PDB 1K0V), соответственно. Указаны аминокислоты, участвующие в координации Cu + с помощью TM-MBS.Схема CopZ включает структуру N-CopZ (идентификационный код PDB 2HU9) и модель гомологии C-CopZ, основанную на Enterococcus hirae CopZ (идентификационный код PDB 1CPZ). Зеленая сплошная линия представляет прямую поставку Cu + компанией CopZ в TM-MBS.
Красные пунктирные линии символизируют перенос Cu + из CopZ в N-MBD и C-MBD и последующее перемещение Cu + из MBD в TM-MBS.
Cu + -АТФазы состоят из восьми трансмембранных сегментов, двух больших цитозольных петель, включающих А-домен и АТФ-BD, и регуляторных металлосвязывающих доменов (MBD) на их N-конце (6, 8⇓–10, 20, 21) (рис.1). A. fulgidus CopA имеет атипичную дополнительную MBD на С-конце. MBD представляют собой домены длиной от 60 до 70 а.о. Они имеют укладку βαββαβ и инвариантную последовательность связывания металла CXXC, аналогичную хорошо описанным шаперонам Cu + , Atox1, Atx1 и CopZ (20, 22, 23). N-MBD связывают Cu + с высокой аффинностью (24⇓–26), а in vivo получают Cu + от соответствующих шаперонов Cu + (23, 27, 28). В бактериальных Cu + -АТФазах делеция этих доменов или мутация Cu + -связывающих остатков Cys не предотвращает металлическую активацию АТФазы, хотя они влияют на скорость оборота фермента (15, 16, 19).
Примечательно, что N-MBD, по-видимому, необходимы для нацеливания и локализации ATPase metal-зависимых в эукариотических системах (9). Инвариантные аминокислоты, присутствующие в трансмембранных спиралях H6 (два Cys), H7 (Asn, Tyr) и H8 (Met, Ser), составляют TM-MBS (рис. 1), ответственные за транслокацию ионов (10, 16, 17). Мутация любого из этих остатков приводит к инактивации фермента за счет предотвращения всех Cu + -зависимых каталитических стадий. Металлоспецифичность определяется TM-MBS, а не MBD. Таким образом, удаление с помощью способности MBD связывать металлы не влияет на селективность в отношении металлов P 1B -ATPases (16, 29⇓–31).
Для классических АТФаз Р-типа (Ca 2+ -АТФаза или Na + ,K + -АТФаза) было хорошо установлено, что связывание свободных цитоплазматических катионов в TM-MBS является критической реакцией в транспортный механизм. Однако Cu + не имеет доступа к АТФазе в виде свободного (гидратированного) иона, а связан с белком-шапероном.
Шапероны Cu + , которые доставляют металл специфически к Cu + -ATPases, были идентифицированы в ряде организмов (4, 20, 22).Недавно мы описали A. fulgidus Cu + шаперон CopZ (32). CopZ содержит С-концевой шаперонный домен Cu + (C-CopZ), гомологичный шаперонам эукариот и бактерий (рис. 1). Кроме того, CopZ имеет необычный 130-aa Cys-богатый N-концевой домен (N-CopZ), содержащий кластер [2Fe-2S] и сайт связывания Zn 2+ . Перенос Cu + от шаперонов Cu + к Cu + -ATPase N-MBD подробно охарактеризован (9, 14, 18, 27, 28, 32, 33).Большинство этих исследований основано на модели, в которой термодинамически неглубокий градиент позволяет направлять Cu + от шаперона к MBD и от них к TM-MBS (обозначено пунктирными красными линиями на рис. 1). Суммарный поток Cu + между этими участками будет кинетически управляться транслокацией металла через мембрану, процесс, активируемый АТФ (28).
Подтверждая эту модель, второй MBD белка Wilson, по-видимому, необходим для Cu + -зависимого фосфорилирования с помощью АТФ с использованием Atox1·Cu + в качестве донора металла (18).Кроме того, MBD кажутся важными для функции белков болезни Вильсона, когда они исследуются в исследованиях функциональной комплементации дрожжей (34). Однако перенос Cu + из МБД в ТМ-МБС не показан. Более того, учитывая, что в бактериальных АТФазах удаление N-MBDs или мутация их остатков Cys, связывающих металлы, не приводит к потере транспорта (15, 16, 19), альтернативная экономная модель кажется правдоподобной. В этой модели сопровождающий будет «напрямую» доставлять металл в TM-MBS, стыкуясь с открытым металлическим входом в TM-MBS (обозначен зеленой линией на рис.1). Этот процесс прямой доставки будет независимым от несущественного нормативного обмена шаперон/MBD Cu + .
Здесь мы представляем доказательства, которые различают эти модели и показывают роль шаперона Cu + в доставке металла к местам трансмембранного транспорта Cu + -АТФаз.
Кроме того, данные показывают отчетливые механистические особенности, которые отличают P 1B -АТФазы от классических переносящих щелочные металлы Р-АТФаз.
Результаты
Cu
+ Связывание с MBD CopA и CopZ. Мы начали эти исследования, охарактеризовав взаимодействие Cu + с MBD A. fulgidus CopA и CopZ. CopA имеет два цитозольных MBD, N-MBD и C-MBD (рис. 1). Эти MBD экспрессировали и очищали отдельно в виде растворимых полипептидов, а связывание Cu + изучали в присутствии индикатора Cu + бицинхониновой кислоты (BCA). Оба домена были способны связывать Cu + , хотя и со значительно разным сродством (фиг. 2 A и B ).N-MBD связал Cu + с K a 6,8 ± 0,8 × 10 11 M -1 , тогда как C-MBD полностью вытеснил Cu + из конкурирующего BCA. Хотя точное определение C-MBD·Cu + K a оказалось невозможным, оно оказалось значительно выше, чем у BCA 2 ·Cu + ( K a = 4,6 × 10 14 M −2 ).
Сазинский и др. (32) показали, что CopZ имеет сайт связывания Cu + в шаперонном домене C-CopZ, но Fe-S-содержащий домен N-CopZ связывает дополнительный Cu + в течение in vitro Cu + загрузка CopZ. Следовательно, на рис. 2 C показано связывание Cu + с CopZ с двумя различными значениями K a : 6,6 ± 2,2 10 14 M -1 и 3 M -1 4,8 ± 1,1 391 10 10 101 ± 1,1 1,1 -1 для C-CopZ и N-CopZ соответственно.Сопоставимые значения были оценены для других шаперонов Cu + и N-MBD (3, 26, 35). Однако более низкие значения K a были получены в исследованиях аналогичных доменов с использованием альтернативных методологий (24, 36). Следовательно, акцент здесь будет сделан на сравнительном анализе параметров Cu + -связывания доменов CopZ и CopA, полученных одним и тем же методом.
Cu + и перенос Cu + между цитозольными MBD и CopZ.
( A–C ) Связывание Cu + с N-MBD ( A ), C-MBD ( B ) и CopZ ( C ), определенное в анализах конкуренции белок/BCA. Данные были подходят с помощью N = 0,12 ± 0,02 и K A = 6,8 ± 0,8 × 10 11 м -1 для N-MBD · Cu + , и N 1 = 1,2 ± 0,2, К а1 = 4,8 ± 1,1 10 11 М -1 , n 2 = 1.3 ± 0,1, К а2 = 6,6 ± 2,2 10 14 М -1 для CopZ·Cu + . Данные C-MBD соответствовали [C-MBD·Cu + ] = n [Cu + ], где n = 0,94 ± 0,04. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3). ( D ) Перенос меди из CopZ в изолированный C-MBD. Показано содержание меди (●) и белка (■) в промывной (W) и элюированной (E) фракциях. Идентифицируют пики, соответствующие специфическим белкам, элюированным из колонки со стрептактином.
Опосредованная шаперонами доставка Cu + в цитозольные MBD была показана для ряда пар шаперон/АТФаза (14, 28, 32). В случае A. fulgidus CopZ и CopA мы показали, что CopZ доставляет Cu + к изолированному N-MBD CopA, хотя и с небольшим кажущимся K eq (32). Учитывая возможную роль C-MBD в доставке Cu + к TM-MBS, мы оценили перенос Cu + из CopZ в этот домен (рис.2 D ). В согласии с относительным K a , CopZ смог пожертвовать Cu + C-MBD более эффективно, чем N-MBD. Этот перенос катионов, по-видимому, происходит за счет специфического взаимодействия с белком, а не за счет диссоциации Cu + от CopZ и последующего связывания с MBD. В подтверждение этого утверждения, когда контрольные эксперименты проводились в отсутствие акцепторов Cu + , <10% Cu + диссоциировали от CopZ·Cu + через 10 мин при комнатной температуре.
Точно так же диссоциация CopZ·Cu + была минимальной (<10%), если белок диализовали против буфера, содержащего C-MBD [см. вспомогательную информацию (SI) , Материалы и методы и рис. S1].
Cu
+ — Связанный N-MBD или C-MBD не активирует CopA Cu + — Зависимый оборот. «Косвенная» модель, изображенная на рис. 1, подразумевает, что цитозольный МБД при получении Cu + от CopZ способен отдавать металл TM-MBS. Чтобы проверить эту гипотезу, определяли активацию CopA, лишенного как N-MBD, так и C-MBD (ΔN,C-CopA), изолированными растворимыми MBD, нагруженными Cu + .ΔN,C-CopA сохранял активность Cu + -АТФазы, сходную с активностью CopA дикого типа, при измерении в присутствии Cu + (фиг. 3 и фиг. S2 A ). Однако активации АТФазы ни N-MBD·Cu + , ни C-MBD·Cu + не наблюдалось даже при 100-кратном молярном избытке MBD·Cu + по сравнению с CopA.
Кроме того, контрольные эксперименты показали, что диссоциация MBD·Cu + в условиях анализа была незначительной или отсутствовала вовсе (см. рис. S3). Эти эксперименты с активностью АТФазы убедительно свидетельствуют о том, что MBD не могут эффективно доставлять Cu + к TM-MBS.Тем не менее, можно утверждать, что: ( i ) особое взаимодействие между MBD и трансмембранной областью необходимо для переноса Cu + на TM-MBS и последующей активации; и ( ii ) это взаимодействие не может быть достигнуто с помощью изолированных растворимых доменов и ΔN,C-CopA. Этот аргумент маловероятен, потому что изолированный MBD·Cu + также был неспособен активировать CopA дикого типа (рис. 3 и рис. S2 B ), хотя большой молярный избыток MBD·Cu + ( до 100:1) гарантированное насыщение сайтов CopA MBD без существенного снижения доступности растворимых MBD·Cu + .
ΔN,C-CopA (□, ■, ▲) и CopA (○, ●, ♦) АТФазная активность в присутствии N-MBD·Cu + или C-MBD·Cu + .
Cu + был включен в среду для анализа в виде свободного вида (□, ○), связанного с N-MBD (■, ●) или с C-MBD (▲, ♦). Данные по активации ΔN,C-CopA Cu + были подобраны с использованием K ½ = 2,2 ± 0,3 мкМ и V max = 2,4 ± 0,1 нмоль мкг 1901 -4 -1 90 . Данные активации CopA Cu + были подобраны с использованием K ½ = 4.5 ± 1,8 мкМ и В макс = 3,2 ± 0,4 нмоль мкг -1 ч -1 . Подгонка для данных N-MBD и C-MBD не предпринималась. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3).
Cu
+ -Связанный CopZ активирует CopA Cu + -Зависимый оборот Независимо от N-MBD и C-MBD. Луценко с соавторами (14, 18) показали роль шаперонов Cu + в активации Cu + -ATPases, установив, что Cu + -нагруженный Atox1 управляет фосфорилированием белка Вильсона с помощью АТФ.
Воспользовавшись полной функциональностью CopA, мы измерили активацию АТФазы с помощью CopZ·Cu + , действующего как один донор Cu + . Как и ожидалось, шаперон Cu + увеличил оборот CopA (рис. 4). Интересно, что фермент V max в присутствии CopZ·Cu + был значительно выше, чем наблюдаемый в присутствии Cu + . Однако активация K ½ была одинаковой как для Cu + , так и для CopZ·Cu + .Поскольку только небольшое количество Cu + диссоциировало от CopZ во время анализа (<15%; см. рис. S1), данные на рис. 4 показывают, что CopZ·Cu + специфически взаимодействует с CopA и активирует его. Однако, принимая во внимание большую активацию CopZ·Cu + , можно утверждать, что CopZ, не содержащий Cu + , действует как акцептор Cu + на внешне обращенном металлическом участке. В этой роли CopZ может ускорить высвобождение Cu + , что, вероятно, является ограничивающим этапом (5).
Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали влияние CopZ, не содержащего Cu + , на активацию CopA (рис. 5). В этих экспериментах АТФазную активность тестировали в присутствии фиксированных концентраций CopZ·Cu + , дающих 50 или 100% максимальной активности, тогда как в реакционную среду добавляли увеличивающиеся количества Cu + , не содержащие CopZ. В обоих условиях на активность АТФазы CopA не влияло добавление CopZ, не содержащего Cu + . Эти результаты подтверждают идею о том, что CopZ, не содержащий Cu + , не влияет на высвобождение Cu + .Более того, CopZ, не содержащий Cu + , не снижал активность, что свидетельствует о том, что он не конкурирует с CopZ·Cu + за предполагаемый сайт стыковки, близкий к TM-MBS.
CopZ·Cu + активация АТФазной активности CopA. Cu + был включен в среду для анализа в виде свободного вида (○) или связанного с CopZ (●).
Данные были подобраны с использованием следующих параметров: свободный Cu + , K ½ = 2,9 ± 1,0 мкМ и V max = 2.5 ± 0,3 нмоль мкг -1 ч -1 ; CopZ·Cu, K ½ = 1,0 ± 0,2 мкМ и В max = 5,5 ± 0,2 нмоль мкг -1 ч -1 . Значения, полученные для CopZ·Cu + , были получены в двух повторах в трех независимых экспериментах. Данные, полученные для свободного Cu + , представляют собой среднее ± стандартная ошибка ( n = 3).
Влияние Cu + -свободного CopZ на CopZ·Cu + -зависимую АТФазную активность CopA.CopA-АТФазную активность измеряли в присутствии 5 мкМ CopZ·Cu + (○) или 1,25 мкМ CopZ·Cu + (□) и Cu + без CopZ при указанных молярных соотношениях. Стопроцентная активность = 4,7 ± 0,2 нмоль мкг -1 ч -1 . Пунктирные линии указывают на активность в отсутствие CopZ, не содержащего Cu + .
Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 3).
Наблюдаемая активация CopA с помощью CopZ·Cu + указывает на прямое взаимодействие и перенос Cu + между этими белками.Если Cu + напрямую переходит от CopZ·Cu + к транспортным сайтам (рис. 1), то CopZ·Cu + должен активировать CopA, лишенный функциональных MBD (ΔN,C-CopA), и CopA, в котором критические остатки Cys находятся в MBD были мутированы в Ala (C 27,30,751,754 A CopA). На рис. 6 показано, что оба белка гидролизуют АТФ в присутствии CopZ·Cu + . Как и в случае полноразмерного CopA дикого типа, активация CopZ·Cu + приводила к значительно более высокому V max , чем наблюдаемое в присутствии свободного Cu + .Таким образом, данные убедительно подтверждают перенос Cu + из CopZ в CopA TM-MBS независимо от MBD.
Рис. 6. CopZ·Cu + активация ΔN,C-CopA и C 27,30,751,754 A CopA АТФазная активность.
Cu + был включен в среду для анализа либо в виде свободного вида (○, □), либо связанного с CopZ (●, ■). Данные соответствуют либо ΔN,C-CopA (○, ●), либо C 27,30,751,754 A CopA (□, ■). Данные были подобраны с использованием следующих параметров: ΔN,C-CopA плюс свободный Cu + , K ½ = 2.4 ± 1,2 мкМ и В макс. = 2,2 ± 0,4 нмоль мкг -1 ч -1 ; ΔN,C-CopA плюс CopZ·Cu, K ½ = 0,3 ± 0,1 мкМ и V max = 9,3 ± 0,4 нмоль мкг –1 ч –1 9; Для C 27 30 751,754 A COPA PLUS Free Cu + , K ½ = 2,3 ± 1,4 мкм и V MAX = 1,2 ± 0,3 NMOL мкг -1 H -1 ; для C 27,30,751,754 A плюс CopA CopZ·Cu, K ½ = 1.0 ± 0,3 мкМ и В макс = 3,1 ± 0,2 нмоль мкг -1 ч -1 . Значения, полученные для CopZ·Cu + , были получены в двух повторах в трех независимых экспериментах.
Данные, полученные для свободного Cu + , представляют собой среднее ± стандартная ошибка ( n = 3).
CopZ Поставляет Cu
+ в TM-MBS CopA. Наши препараты CopA состоят из белков, солюбилизированных в смешанных мицеллах липидов/детергентов. Эти формы CopA подходят для проведения экспериментов по переносу Cu + способом, аналогичным тому, который используется для измерения обмена растворимого CopZ-MBD Cu + .С этой целью перенос Cu + измеряли путем инкубации CopZ·Cu + с апо-ΔN,C-CopA в условиях отсутствия оборота: т.е. без Mg 2+ -АТФ. На рис. 7 показано, что в этих экспериментах наблюдалось элюирование Cu + -связанного ΔN,C-CopA. Поскольку TM-MBS является единственным сайтом Cu + в ΔN, C-CopA, можно предположить модель прямой доставки для переноса Cu + . В соответствии с данными на рис. 5 этот результат также показывает, что: ( i ) TM-MBS·Cu + K a значительно выше, чем у CopZ·Cu + ; и ( ii ) перенос Cu + является по существу необратимым, поскольку Cu + все еще связан с ΔN,C-CopA после относительно медленной промывки и элюирования с колонки.
Предварительные эксперименты указывают на K a в фемтомолярном диапазоне для TM-MBS·Cu + (E. Eren, MG-G. и JMA, неопубликованные результаты). Однако, поскольку условия анализа (4°C, молярное соотношение CopZ·Cu + :CopA 2,6:1) не могут гарантировать насыщение TM-MBS, выводы о стехиометрии связывания сделать нельзя. Тем не менее, кажущаяся высокая аффинность связывания Cu + , по-видимому, подтверждает два приведенных выше вывода.
Переход меди из CopZ в ΔN,C-CopA.Показано содержание меди (●) и белка (○) в промывной (W) и элюированной (E) фракциях. Идентифицируют пики, соответствующие специфическим белкам, элюированным с колонки Ni 2+ — нитрилотриуксусной кислотой.
Обсуждение
CopZ Переносит Cu
+ Непосредственно в TM-MBS. Центральным элементом трансмембранного транспорта металлов Cu + -АТФазами является связывание металла с TM-MBS. Этот сайт определяет специфичность металла и является местом, где происходит транслокация металла.
Целью данной работы было проверить альтернативные модели доставки Cu + в ТМ-MBS (рис. 1), процесс, который основан не на свободной диффузии металла, как в АТФазах, транспортирующих щелочной металл, а на специфическом взаимодействии между два белка, шаперон Cu + и соответствующая ему Cu + -АТФаза. Для этих исследований использовали систему A. fulgidus CopZ/CopA.
Первоначальные эксперименты характеризовались переносом Cu + из CopZ в оба MBD, присутствующих в CopA.В соответствии с их относительными константами ассоциации белок·Cu + реакция переноса CopZ·Cu + + N-MBD ↔ CopZ + N-MBD·Cu + существует в существенном равновесии (32). Следовательно, занятость позиций N-MBD Cu + будет зависеть от уровня CopZ·Cu + . Аналогичная ситуация, вероятно, имеет место и для других АТФаз, где K eq ≈0,5–1,5 наблюдалось для обмена Cu + (14, 26, 28).
В соответствии с этим мутация N-MBD Cys приводит к значительному снижению скорости оборота АТФазы (16), а усечение этих доменов приводит к более высокой ферментативной активности (37), особенно во время активации CopZ·Cu + (рис.6). Эти наблюдения обеспечивают дополнительную поддержку регуляторного механизма, в котором повышение уровней Cu + приведет к увеличению пула шаперонов·Cu + , последующему переносу Cu + в N-MBD, замещению N-MBD. · Cu + из конформации с медленным оборотом (возможно, обеспечивая лучший доступ шаперона к TM-MBS) и, как следствие, более высокая скорость оборота/транспорта Cu + -ATPase (14, 16, 18, 19). Однако в конкретном случае А.fulgidus CopA, небольшой избыток CopZ·Cu + насыщает сайты связывания C-MBD, указывая на K eq ≫ 1 для CopZ·Cu + . Затем in vivo насыщение сайтов C-MBD Cu + будет происходить до того, как будут присутствовать значительные уровни CopZ·Cu + , поэтому C-MBD не будут «чувствовать» концентрацию CopZ·Cu + .
Интересно, что мутация двух Cys в C-MBD, т. е. удаление его способности связывать Cu + , не оказывала заметного влияния на активность фермента (16).
Для идентификации видов, отдающих Cu + CopA TM-MBS, была протестирована активация CopA АТФазы дикого типа Cu + , нагруженными CopZ, N-MBD и C-MBD. Избыток добавленных Cu + связанных цитоплазматических доменов (N-MBD или C-MBD) не был способен активировать ни CopA, ни ΔN,C-CopA. Это наблюдение убедительно подтверждает идею о том, что Cu + , связанные с MBD, не могут быть впоследствии перенесены в TM-MBS. Альтернативно, поскольку CopZ·Cu + активировал оба фермента, оказалось, что CopZ доставляет Cu + к TM-MBS независимо от присутствия функциональных MBD в АТФазе.В подтверждение этой модели CopZ·Cu + переносит металл на ΔN,C-CopA, фермент, в котором только TM-MBS остается в качестве акцептора Cu + .
Принимая во внимание альтернативные механизмы, предыдущие исследования показали, что шаперон·Cu + -зависимое фосфорилирование белков болезни Вильсона требует, по крайней мере, функционального MBD2 (18).
Как предполагают авторы, в этом случае может потребоваться связывание Cu + для смещения MBD2 от блокирования доступа шаперона·Cu + к TM-MBS (18).С другой стороны, эукариотические белки с несколькими MBD и прокариотические/архейные белки с одним MBD могут иметь разные транспортные механизмы. Например, можно постулировать, что при связывании Cu + N-конец мульти-MBD подвергается конформационному изменению, которое направляет N-MBD·Cu + к мембране. Однако наши данные предполагают, что этот и другие альтернативные механизмы не являются наиболее подходящей моделью, но они поддерживают механизм, при котором CopZ (а не MBD) доставляет Cu + к TM-MBS.
Взаимодействие CopZ–CopA.
Хотя шаперонный домен MBD CopZ и CopA в высокой степени гомологичен и имеет схожую структуру, только CopZ способен доставлять Cu + к TM-MBS. Более того, CopA, по-видимому, не взаимодействует с CopZ, не содержащим Cu + .
Вместо этого CopA, по-видимому, различает очень похожие структуры: CopZ без Cu + и CopZ·Cu + . В связи с этим Са +2 -АТФазы представляют собой «воронкообразную» структуру, состоящую из h2, h4 и А-домена (12, 38), в цитоплазматическом доступе к Glu 309 , первый остаток в Ca 2+ -ATPase TM-MBS.Подобная архитектура может присутствовать в Cu + -ATPases, где концы h4 (эквивалентно h2 SERCA1), H5 (эквивалентно h4 SERCA1) и А-домен могут представлять собой сайт стыковки для CopZ·Cu. + и прямой перенос Cu + на Cys 382 (функциональный аналог Glu 309 в SERCA1).
Механизм Cu
+ Транспорт. Наши эксперименты также иллюстрируют механистические аспекты Cu + -ATPases.В случае Ca 2+ — и Na + ,K + -ATPases транспортируемые катионы связываются обратимо, и фосфорилирование белка необходимо для предотвращения цитоплазматического высвобождения транспортируемых наружу ионов (11, 12).
Эксперимент по переносу CopZ/ΔN,C-CopA Cu + показывает, что в Cu + -АТФазах связывание металла с цитоплазмой, обращенной к TM-MBS, по существу необратимо. Это свойство, вероятно, достигается плотным связыванием Cu + (через довольно маленькое k от ) и очевидным низкоаффинным взаимодействием CopZ, не содержащего Cu + , с его сайтом стыковки в CopA.В этом случае фосфорилирование белка не требуется для предотвращения высвобождения ионов в обратном направлении; однако Cu + -связанная форма CopA, полученная в отсутствие других лигандов, может не обязательно быть эквивалентной переходным конформациям с окклюзией катионов, описанным для P 2 -ATPases (11, 12). Исследования, изучающие координацию Cu + во время транспорта, могут прояснить этот момент.
С другой стороны, векторный перенос Cu + из CopZ в CopA TM-MBS и в значительной степени необратимое связывание Cu + с TM-MBS подразумевает высокий TM-MBS·Cu + K значение .
Можно видеть, что это противоречит Cu + и CopZ·Cu + K ½ для активации АТФазы в микромолярном диапазоне. Однако ТМ-МБС·Cu + К а отражает только равновесие Cu + + ТМ-МБС ↔ ТМ-МБС·Cu + , тогда как К 8 ½ продукт нескольких равновесий в каталитическом цикле. Например, CopA в форме E1, доступная для связывания Cu + , зависит от равновесия E1↔E2; альтернативно, форма TM-MBS·Cu + CopA будет фосфорилирована и зависит от равновесия E1P(Cu + ) ↔ E2P + Cu + .
Резюме.
Эксперименты, описанные здесь, показывают, что Cu + шаперон CopZ доставляет Cu + к сайтам трансмембранного транспорта Cu + -ATPase. Регуляторные цитоплазматические МБД не могут выполнять эту функцию. Механические характеристики Cu + -ATPase (по существу, необратимое связывание металла с TM-MBS и высокий оборот в присутствии шаперона Cu + ) приводят к эффективному внешнему векторному транспорту с минимальной утечкой свободного металла внутрь.
Материалы и методы
Клонирование кДНК, экспрессия белков и очистка. кДНК A CopA получали, как описано (5, 16, 32). Конструкцию, кодирующую укороченный CopA, простирающийся от Gly
80 до Gly 736 и, следовательно, лишенный N-MBD и C-MBD (ΔN,C-CopA), получали с помощью ПЦР с использованием CopA в качестве матрицы. Полученную кДНК клонировали в вектор pBAD-TOPO (Invitrogen), который добавляет последовательность His-метки на С-конце.кДНК, кодирующие первые 77 а.о. CopA, Met 1 –Leu 77 (N-MBD), и последние 80 а.о., Leu 725 –Ser 804 (C-MBD), получали методом ПЦР. с использованием кДНК CopA в качестве матрицы. Эти кДНК расщепляли с помощью BsaI и клонировали в pPRIBA1 (IBA), которая добавляет последовательность метки стрептавидина (Strep) на С-конце. Экспрессию белка индуцировали в течение 3 ч добавлением 0,02% арабинозы к клеткам, содержащим векторы на основе pBAD-TOPO, или 1 мМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозида к клеткам, содержащим плазмиды на основе pCRT7/NT-TOPO и pPRIBA1.
Связанные с мембраной белки, CopA, C 27,30,751,754 A CopA и ΔN,C-CopA получали, как описано в ссылке. 5. Во всех экспериментах эти белки находились в растворимой форме, стабилизированной в смешанных мицеллах 0,01% додецил-β-d-мальтозида (ДДМ), 0,01% азолектина. Клетки, экспрессирующие растворимые белки, N-MBD, C-MBD и CopZ, разрушали ультразвуком в 100 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, и гомогенаты центрифугировали при 10000 × g в течение 30 мин. Полученные супернатанты центрифугировали при 110000× g в течение 60 мин.CopZ-His очищали с использованием колонки Ni 2+ -нитрилотриуксусной кислоты и хранили в 25 мМ трис (рН 8,0), 100 мМ сахарозы, 50 мМ NaCl и 10 мМ аскорбата. N-MBD, C-MBD и CopZ-Strep очищали путем пропускания через колонку Strep-Tactin SuperFlow (IBA). Эти белки хранили в 100 мМ Трис (рН 8,0), 150 мМ NaCl и 10 мМ аскорбате при -80°С. Определение белка проводили в соответствии с Bradford (39).
Cu
+ Загрузка белков.
НагрузкуCu + на апо N-MBD, C-MBD и CopZ проводили путем инкубации каждого белка в присутствии 10-кратного молярного избытка CuSO 4 , 25 мМ Hepes (pH 8.0), 150 мМ NaCl и 10 мМ аскорбата в течение 10 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Несвязанный Cu + удаляли пропусканием через колонку Sephadex G-10 (Sigma). Количество связанного Cu + определяли методом BCA (40). В качестве стандартов использовали растворы CuSO 4 .
Cu
+ -Аффинность связывания. Белок·Cu + K a Значения были определены с использованием анализа конкуренции с БСА с последующим колориметрическим определением комплекса БСА 2 ·Cu + при 360 нм.Из-за различного сродства Cu + исследуемых белков были использованы различные подходы. N-MBD·Cu + K a определяли титрованием BCA в растворе 10 мкМ Cu + , 100 мкМ N-МБД в 50 мМ Hepes (pH 7,5), 200 мМ NaCl и 200 мкМ аскорбата (буфер H). 5] / [BCA бесплатно ] 2 [CU + бесплатно ], где K BCA — константа ассоциации для BCA 2 ·Cu + (4.60 × 10 14 М −2 ) (26). N-MBD · Cu + и COPZ · Cu + K A Значения были рассчитаны с помощью ν = [Cu + бесплатно ] N K A / (1 + K a [Cu + свободный ] n ), где ν — молярное отношение металла, связанного с белком, а n — количество сайтов связывания металла. Для оценки переноса Cu + из CopZ в C-MBD C-MBD связывали со смолой Strep-Tactin, уравновешенной в 25 мМ Hepes (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 10 мМ аскорбиновой кислоты (буфер M). CopZ-His, полностью загруженный Cu + , добавляли в 3-кратном избытке к связанному со смолой C-MBD CopA и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре для замены Cu + . Белки разделяли промывкой колонок со смолой буфером М с последующей элюцией 2.5 мМ дестиобиотина в буфере М. Фракции промывки и элюирования собирали и анализировали на Cu + и содержание белка. Перенос Cu + с CopZ на ΔN,C-CopA осуществляли аналогичным образом, за исключением того, что ΔN,C-CopA связывали с колонкой Ni 2+ -нитрилотриуксусной кислоты, а 3 М избыток меченого Strep CopZ использовали в качестве донора Cu + . Исследования проводились при 75°C в среде, содержащей 50 мМ Трис (pH 6.1 при 75°C), 3 мМ MgCl 2 , 3 мМ АТФ, 0,01 % азолектина, 0,01 % ДДМ, 400 мМ NaCl, 2,5 мМ ДТТ и 20–40 мкг/мл очищенного белка. Концентрации Cu + либо в свободной форме, либо в связанном с белками виде варьировали, как показано на соответствующих рисунках. N-MBD·Cu + , C-MBD·Cu + или CopZ·Cu + использовали сразу после удаления несвязанного Cu + . Мы благодарим Drs. Элиф Эрен и Джошуа Берлин (Университет медицины и стоматологии Нью-Джерси – Медицинская школа Нью-Джерси) за полезные обсуждения и предложения, Брэд Кауфман за неоценимую техническую помощь и доктор Мэтт Сазински (Северо-Западный университет) за ΔN,C-CopA pBAD построить. Вклад авторов: J.M.A. проектное исследование; М.Г.-Г. проведенное исследование; М.Г.-Г. и Дж.М.А. проанализированные данные; и М.Г.-Г. и Дж.М.А. написал бумагу. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Эта статья является прямой отправкой PNAS. Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0711446105/DCSupplemental. Цинк является важным питательным веществом для организма; он необходим для каталитической активности многих сотен ферментов человека и практически всех биологических процессов, поэтому его гомеостаз и транспортировка представляют большой интерес.Сывороточный альбумин является основным носителем Zn 2+ в крови и необходим для его системного распределения. Здесь мы представляем первые кристаллические структуры альбумина сыворотки человека (HSA) и альбумина сыворотки лошади (ESA) в комплексе с Zn 2+ . Структуры позволяют однозначно идентифицировать основной сайт связывания цинка на этих двух альбуминах, а также несколько дополнительных, более слабых сайтов связывания цинка. Эта статья находится в открытом доступе В этом блоге я кратко опишу шаги, необходимые для переноса сайта портала на облачную платформу SAP с помощью новой облачной службы управления транспортом (в настоящее время доступна в виде бета-версии).Существует несколько способов переноса сайта портала, наиболее распространенным из которых является экспорт/импорт сайта между учетными записями облачной платформы. Другой вариант переноса сайтов портала — использовать локальную CTS+. Арне Стич (Arne Stich) опубликовал отличный блог о переносе порталов с помощью CTS+. CTS+ — отличный вариант, когда у вас гибридный ландшафт и вам необходимо связать изменения вашего облачного портала с запросами на изменение в локальной системе. Это также становится актуальным, когда вам необходимо интегрироваться с локальным инструментом управления изменениями, таким как Solution Manager ChaRM.Хотя это отличный вариант, он может быть не лучшим выбором для всех. Основываясь на нескольких реализациях CTS+/ChaRM, которые я видел, существует жесткое управление подачей запросов на изменение и продвижением изменения на всем пути к производству. В некоторых случаях я видел, что в организациях очень мало окон изменений, и они реже позволяют изменениям поступать в рабочую среду. Это не просто так — чтобы защитить свои основные системы. SAP Cloud Platform — это гибкая инновационная платформа, которая позволяет организациям развертывать приложения за несколько недель.Это место, где они могут экспериментировать со всеми новыми технологиями и иметь возможность вывести свою продукцию на рынок в более короткие сроки. Существует исчерпывающая справочная документация SAP для службы управления транспортом. На сегодняшний день он поддерживает транспорт следующих Важно отметить, что служба управления транспортом работает в среде Cloud Foundry, несмотря на то, что она поддерживает транспортировку облачных артефактов в среде Neo.На изображении ниже вы заметите, что ландшафтные конфигурации могут быть созданы с набором узлов и маршрутов, чтобы определить, как транспортное содержимое перемещается в ландшафте. Схема чертежей была упомянута в этом блоге Первое, с чего вам нужно начать, это подписка на службу управления транспортом.Поскольку эта услуга доступна в рамках программы закрытого бета-тестирования, вам необходимо запросить участие. Уже есть несколько замечательных блогов, опубликованных звездами сообщества Эти блоги посвящены использованию этой службы для переноса приложений Cloud Platform Integration и SAPUI5. Большинство из этих шагов уже рассмотрены, но я сосредоточусь на шагах по переносу сайтов Portal. После того, как вы назначите соответствующие подписки для своей глобальной учетной записи в Cloud Foundry, вы сможете перейти к Правам и назначить квоту субаккаунтам.В приведенном ниже примере я назначил квоту субсчету с именем «TMS». В своей субучетной записи включите подписку «Приложения SaaS — Служба управления транспортом». Следующим шагом является создание коллекции ролей и назначение соответствующих ролей. В разделе «Безопасность» > «Коллекции ролей» создайте новую коллекцию ролей. Я дал имя «TMS_RC». В наборе ролей добавьте роль для приложения «alm-ts!t339» и выберите «Администратор» для шаблона и роли роли. Наконец, вам нужно будет добавить эту новую коллекцию ролей в свой профиль. В разделе «Безопасность» > «Конфигурация доверия» выберите «Служба SAP ID». Укажите данные о пользователе и нажмите «Добавить назначение», чтобы назначить пользователя новой коллекции ролей. Если кнопка не активирована, попробуйте сначала нажать «Показать задание». После этого вы должны быть готовы получить доступ к службе управления транспортом. Нажмите на ссылку «Перейти к приложению». Откроется новое окно и вы попадете в службу управления транспортом. На обзорном экране вы получаете снимок текущего состояния — очередь импорта и количество успешных/неудачных импортов. Ландшафтную конфигурацию можно выполнить с помощью пунктов меню с левой стороны. Перед этим я хотел бы показать вам настройку моих учетных записей в среде Neo. У меня есть глобальная учетная запись «ITeLO» в Neo Environment и 3 дочерних учетных записи — DEV/TST/PRD.В этом блоге я собираюсь показать, как перемещать сайты портала от DEV до TST и PRD. Теперь давайте вернемся в среду Cloud Foundry и настроим места назначения для этих 3 дочерних учетных записей в среде Neo. На приведенном ниже снимке экрана я создал 3 пункта назначения, а именно «TMS_To_DEV», «TMS_To_TST» и «TMS_To_PRD», каждый из которых указывает на конечные точки жизненного цикла решения в каждой дочерней учетной записи. В случае развертывания MTA на Neo конечной точкой развертывания является служба управления жизненным циклом решений: https:// Solutions Lifecycle Management можно найти как отдельную услугу в среде Neo. Перейдите к службе управления транспортом и создайте ландшафтную конфигурацию. В меню мастера ландшафта выберите ландшафт узла. В моем примере у меня три системных ландшафта — DEV/TSTS/PRD. Следовательно, я выбрал «Пейзаж с тремя узлами». Транспортные узлы представляют исходную и целевую конечные точки процесса развертывания.Перевозки осуществляются между транспортными узлами. Укажите осмысленное имя для каждого из узлов и выберите поддерживаемые типы контента. Обратите внимание, что местам назначения, созданным ранее, также необходимо назначить соответствующие узлы. Наконец, определите транспортные маршруты, которые используются для соединения транспортных узлов. Продолжайте работу мастера, и в сводке вам будет предоставлен список созданных узлов/маршрутов. Перейдите в меню «Транспортные узлы», и вы сможете увидеть список всех созданных узлов. Щелкнув по транспортному узлу, вы перейдете к подробному экрану, на котором показана очередь импорта, а также связанные маршруты. На этом мы завершили все этапы настройки службы управления транспортом. Теперь пришло время переключиться на среду Neo и начать работу с сайтами портала. Я развернул несколько приложений HTML5, а также темы, которые будут использоваться на моем портале. Скриншот ниже взят из субаккаунта DEV в среде Neo. В каталоге сайтов у меня есть один сайт-портал под названием «Портал поставщиков», который находится в опубликованном состоянии. Этот сайт портала основан на панели запуска Fiori и ссылается на несколько приложений HTML5, развернутых в той же дочерней учетной записи. Этот сайт также привязан к теме. Я могу начать процесс экспорта, используя параметр «Экспорт» в каталоге сайтов. Во всплывающем окне «Экспорт сайта» я выбираю параметр «Пакет содержимого».При этом будут экспортированы все артефакты портала, включая приложения и темы HTML5. Результатом является архив многоцелевого приложения (файл . В качестве администратора транспорта вы можете перейти к службе управления транспортом, выбрать транспортный узел «DEV» и использовать кнопку «Добавить», чтобы загрузить файл .mtar в очередь. Во всплывающем окне загрузки файла выберите файл .mtar, как показано ниже. Это обновит состояние содержимого транспорта до исходного состояния.Когда я нажимаю кнопку «Импорт», это будет импортировать транспортный пакет в транспортный узел DEV, и статус изменится на «Успешно». Я переключаюсь обратно на субаккаунт DEV в среде Neo и вижу развертывание нового решения в меню «Решения». Имя решения соответствует идентификатору сайта портала. Нажатие на это решение приведет меня к подробному экрану, где я могу просмотреть соответствующие приложения/темы HTML5/конфигурацию сайта портала, которые он содержит. На обзорном экране службы управления транспортом я также вижу, что есть импорт, который находится на рассмотрении в среде TST. Как администратор транспорта я могу открыть транспортный узел «TST» и убедиться, что транспортный пакет теперь находится в очереди импорта среды TST. Я могу нажать кнопку «Импорт», чтобы начать процесс импорта. Как только статус изменится на «Успешно», я смогу найти решение, развернутое в субаккаунте TST среды Neo. Аналогично, приложения/темы портала HTML5 также были бы перенесены Сайт портала находится в автономном режиме в каталоге сайтов, и его необходимо опубликовать. Вскоре после публикации сайта мы можем исследовать приложения в среде TST. Вы можете повторить тот же процесс, чтобы продолжить изменение ландшафта PRD отсюда. Служба управления транспортом также предлагает подробные журналы для каждого выполненного действия Вы можете перейти к каждому из действий и просмотреть соответствующие объекты, которые переносятся между учетными записями. Я очень рад этому новому сервису на платформе SAP Cloud Platform и хотел бы поблагодарить Харальда Стивенса за предоставленную мне возможность использовать сервис управления транспортом, который в настоящее время находится в стадии бета-тестирования. Это важный шаг для управления жизненным циклом приложений/решений на SAP Cloud Platform.
C-MBD·Cu + K a определяли титрованием Cu + в растворе 25 мкМ C-MBD, 250 мкМ BCA в буфере H. CopZ K a значений получали путем титрования Cu + в растворе 20 мкМ BCA, 80 мкМ CopZ в буфере H.Молярный коэффициент экстинкции BCA 2 ·Cu + , ε 360 = 20 600 см -1 M -1 , определяли титрованием 10 мкМ Cu + в буфере HCA. , Концентрации свободных металлов были рассчитаны по к к BCA = [BCA 2 · CU +
Зарегистрированные ошибки для K a и n являются асимптотическими стандартными ошибками, полученными с помощью программного обеспечения для настройки (Origin; OriginLab). Cu
+ Анализ переноса.
Белки разделяли промывкой 25 мМ Hepes (рН 8,0), 100 мМ сахарозой, 500 мМ NaCl, 0,01% ДДМ, 0,01% азолектином, 10 мМ аскорбиновой кислотой, 20 мМ имидазолом с последующей элюцией 25 мМ Hepes (рН 8.0), 100 мМ сахарозы, 500 мМ NaCl, 0,01 % ДДМ, 0,01 % азолектина, 10 мМ аскорбиновой кислоты, 300 мМ имидазола. Отсутствие C-MBD или ΔN,C-CopA в промывных фракциях и CopZ в элюированных фракциях подтверждали с помощью SDS/PAGE. Были проведены контроли, в которых CopZ-His, CopZ-Strep, apoC-MBD и ΔN,C-CopA, нагруженные Cu + , подвергались одинаковым процедурам по отдельности, т. Анализы АТФазы.
Контроли с апоN-MBD, C-MBD или CopZ, не содержащими Cu + , при необходимости использовали в качестве контрольных образцов.Активность АТФазы измеряли после 10-минутной инкубации, за исключением того, что когда N-MBD действовал как донор Cu + , проводили 5-минутные инкубации. Высвобожденный P i определяли согласно Lanzetta et al. (41). Из нанесенных на график значений вычитали активность АТФазы, измеренную в отсутствие металла. Кривые активности АТФазы по отношению к концентрациям донора·Cu + (N-MBD, C-MBD или CopZ) соответствовали v = V max [донор·Cu + ]/([донор ·Cu + ]+ K ½ ).Сообщаемые стандартные ошибки для V max и K ½ являются асимптотическими стандартными ошибками, сообщаемыми программой подбора KaleidaGraph (Synergy). Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда MCB-0235165 (в JMA). Сноски
Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:01:53 3. 
03 46,21% 2 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +1 00:04:02 5. 
15 35,94% 3 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -1 00:05:54 8. 
02 23,68% 4 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:02:04 2. 
89 56,78% 5 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:03:46 3. 
71 54,05% 6 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:04:39 2. 
44 46,30% 7 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:09:02 9. 
31 23,54% 8 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +2 00:04:33 2. 
54 42,00% 9 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:04:17 4. 
14 30,22% 10 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:02:13 3. 
14 61,45% 11 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -7 00:03:16 3. 
51 48,75% 12 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -6 00:06:14 10. 
92 34,06% 13 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:04:04 2. 
53 52,71% 14 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +4 00:03:07 3. 
52 28,52% 15 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:02:55 2. 
89 54,97% 16 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +1 00:03:19 4. 
03 46,08% 17 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +1 00:02:45 5. 
31 55,69% 18 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -1 00:04:09 6. 
38 27,62% 19 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -3 00:10:19 8. 
54 27,36% 20 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +5 00:06:19 7. 
04 30,53% 21 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +2 00:12:27 10. 
91 26,65% 22 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +2 00:03:31 2. 
55 44,11% 23 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -2 00:11:18 11. 
45 20,14% 24 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -1 00:02:04 3. 
63 32,82% 25 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -1 00:01:06 2. 
38 37,96% 26 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +5 00:03:28 4. 
44 29,69% 27 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -4 00:04:50 4. 
20 34,86% 28 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +1 00:04:54 5. 
07 28,62% 29 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -1 00:07:31 17. 
19 32,15% 30 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -5 00:03:20 2. 
71 50,40% 31 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +1 00:05:32 4. 
40 40,46% 32 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:06:02 4. 
97 29,47% 33 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -1 00:03:54 3. 
35 38,82% 34 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -62 00:07:06 4. 
69 37,39% 35 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -2 00:06:04 12. 
80 31,02% 36 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -3 00:07:43 9. 
54 17,48% 37 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -7 00:09:06 7. 
41 26,52% 38 Путешествия и туризм > Наземный транспорт знак равно 00:04:53 4. 
19 4,31% 39 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -4 00:04:18 5. 
14 37,59% 40 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +8 00:02:45 3. 
81 38,80% 41 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -5 00:07:51 6. 
51 27,53% 42 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -19 00:00:39 1. 
66 67,11% 43 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -12 00:02:14 3. 
30 50,98% 44 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -2 00:05:01 2. 
99 36,70% 45 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +35 00:01:43 1. 
78 71,58% 46 Путешествия и туризм > Наземный транспорт -3 00:04:54 7. 
16 32,67% 47 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +8 00:01:31 2. 
58 45,98% 48 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +6 00:06:09 4. 
63 39,88% 49 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +4 00:02:32 2. 
97 57,23% 50 Путешествия и туризм > Наземный транспорт +3 00:05:23 3. 
86 41,53% Циркуляторный транспорт цинка контролируется отдельными междоменными сайтами альбуминов млекопитающих
Основной сайт как в HSA, так и в ESA имеет тетраэдрическую геометрию и включает три белковых лиганда из боковых цепей His67, His247 и Asp249 и молекулу воды.Калориметрические исследования изотермического титрования мутанта HSA H67A подтверждают, что это сайт с наивысшей аффинностью Zn 2+ . Кроме того, анализ связывания Zn 2+ с ЧСА и ЭСА показал наличие вторичных сайтов с в 20–50 раз более слабым сродством, что может иметь значение при определенных физиологических условиях. Как калориметрия, так и кристаллография предполагают, что ESA обладает дополнительным сайтом по сравнению с HSA, включающим Glu153, His157 и His288.Остаток His157 заменен на Phe в HSA, неспособном к координации металлов. В совокупности эти результаты имеют решающее значение для нашего понимания роли сывороточного альбумина в циркуляторном обращении Zn 2+ и клеточной доставке.
..
Что-то пошло не так. Попробуй снова? сайтов транспортного портала с использованием службы управления транспортом на платформе SAP Cloud Platform
Следовательно, существует потребность в простом управлении транспортом на облачной платформе, которое не всегда должно полагаться на локальную систему или локальный процесс управления изменениями. Я считаю, что именно здесь подходит новая служба управления транспортом на SAP Cloud Platform. Это отлично подходит для организаций, ориентированных на облако, и для тех, кому не требуется система на основе ABAP для транспортировки облачных артефактов.
Направления устанавливаются для связи с субаккаунтами в среде Neo. Я объясню это подробно, пока буду выполнять следующие шаги.
mtar), который можно скачать.
100 лучших транспортных сайтов
100 лучших транспортных сайтов
Нажмите здесь , чтобы предложить новый сайт для этого списка.
Нажмите на x рядом со списком, чтобы автоматически сообщить редактору этой страницы о плохой ссылке.
Решения проблемы городского автомобиля.
Сторонники разумного роста. Включает в себя последние отчеты о кампании транспорта и качества жизни.
Миссия APTA состоит в том, чтобы служить и представлять своих членов в превращении общественного транспорта в эффективный путь к экономическим возможностям, личной мобильности и улучшению качества жизни посредством партнерства, коммуникации, технологий и защиты интересов.
CTAA — это ассоциация организаций и отдельных лиц, стремящихся улучшить мобильность для всех людей.
Некоммерческая организация, работающая с сообществами для сохранения неиспользуемых железнодорожных коридоров путем преобразования их в маршруты, улучшая здоровье окружающей среды, экономики, районов и людей Америки.
Предоставляет информацию о транспортных средствах, работающих на альтернативных видах топлива, заправках, руководство для покупателей и другую информацию.
Включает информацию о стратегическом плане и исследованиях FTA, а также ссылки на несколько программ общественного транспорта FTA.
Калифорнийский университет в Беркли является одним из ведущих мировых центров транспортных исследований, образования и научных исследований
Электронный информационный центр защита пешеходов и политика.
Организация, выступающая за федеральные инвестиции в национальную транспортную инфраструктуру для удовлетворения общественного спроса на безопасную и эффективную транспортную сеть для бизнеса.
ULI занимается такими вопросами, как дорожное движение и землепользование, парковка, транзитные поселки и другие транспортные вопросы, как государственные, так и частные.
ATRA работает над тем, чтобы сосредоточить внимание на еще не удовлетворенных потребностях городского транспорта и на том, как передовые концепции общественного транспорта могут помочь их удовлетворить.
Миссия PATH: применение передовых технологий для повышения пропускной способности и безопасности автомагистралей, а также уменьшения пробок на дорогах, загрязнения воздуха и потребления энергии.
Официальный сайт Министерства транспорта США.
Признанная на национальном уровне программа, служащая важным ресурсом для политиков, специалистов в области транспорта, системы образования и общественности.
Виртуальная библиотека для транспортного сообщества.
Способствует государственно-частному партнерству для повышения безопасности и эффективности наземного транспорта за счет применения передовых технологий.
Принципиальный некоммерческий механизм финансирования передовых транспортных исследований, разработки и демонстрации технологий в регионе с участием нескольких штатов.
Целью ассоциации является поощрение планирования, которое будет способствовать общественному благополучию путем развития сообществ и среды, которые более эффективно удовлетворяют потребности людей и общества.
Некоммерческая ассоциация членов правительства и представителей отрасли, выступающая в качестве нейтрального форума для обсуждения транспортных вопросов и проблем.
Sierra Club поддерживает общественный транспорт, пешеходные и велосипедные маршруты.
Центр космических полетов им. Маршалла в Хантсвилле, штат Алабама, возглавляет инициативы НАСА по значительному улучшению доступа к космосу.
Маршалл является ведущим центром НАСА по разработке космических транспортных систем и центром передового опыта в области космических двигателей.
Последние новости общественного транспорта, объявления, веб-ресурсы, FAQ по TEA-21 и многое другое.
«Разработка, оценка и маркетинг технологических продуктов для улучшения нашей транспортной системы.»
Закон о транспортном равенстве для 21 века был принят 9 июня 1998 г. как публичный закон 105-178. TEA-21 санкционирует федеральные программы наземного 6-летний период 1998-2003 гг. ресурс, обеспечивает защиту по транспортным вопросам, связанным с пригородными альтернативами, и предлагает своим членам возможности для общения и профессионального развития.
Информационная служба для транспортной отрасли.
На протяжении почти двух десятилетий журнал Electric Vehicle Progress был источником новостей, данных и аналитических материалов об индустрии электромобилей и гибридных автомобилей.
Программа совместных исследований в области транспорта (TCRP) служит одним из основных средств, с помощью которых транспортная отрасль может разрабатывать инновационные краткосрочные решения для удовлетворения предъявляемых к ней требований.
Информация о велосипедных дорожках из всех 50 штатов.
Бюро транспортной статистики (БТС) собирает, анализирует и делает доступной информацию о национальных транспортных системах; собирает информацию об интермодальных перевозках и других областях по мере необходимости; и работает над повышением качества и эффективности государственной статистики.
Аргоннская национальная лаборатория разрабатывает технологии, которые помогут сделать современные транспортные средства реальностью
Служит сообществам по всей территории Соединенных Штатов, предоставляя материалы, стратегии и другие формы поддержки.
Сайт для повседневных велосипедистов.
Управляет несколькими образовательными учебными программами, посвященными усовершенствованию транспорта.
Последние новости, технологические отчеты, исследования и многое другое, касающееся электрического общественного транспорта.
Экономическое обоснование правительства США для общественного транспорта в Америке.
EVAA — отраслевая ассоциация, работающая над продвижением электромобилей и поддерживающей инфраструктуры посредством политики, информации и развития рынка в Соединенных Штатах.
Одна из многих активных транспортных групп в Оттаве, которые считают, что автомобильная культура оказывает «самое распространенное негативное влияние на качество жизни».
Будущее общественного транспорта. Велосипедная транспортная система Transglide 2000 от BTS увеличивает мобильность в городе за долю стоимости традиционных видов городского общественного транспорта.
«Эта ассоциация обеспечивает связь с государственными и отраслевыми профессионалами, заинтересованными в применении передовых высокоскоростных наземных технологий».
Способствует внедрению технически интегрированной и юрисдикционно скоординированной транспортной системы по всей стране.
AASHTO обещает служить департаментам-членам, Министерству транспорта США и Конгрессу, обеспечивая лидерство, технические услуги, информацию и консультации, а также внося свой вклад в национальную политику по транспортным вопросам.
Служит нуждам и интересам MPO по всей стране, которые отвечают за планирование, программирование и координацию инвестиций в федеральные дороги и транспорт.
Содержит планы развития общественного транспорта для 22 городов Северной Америки.
Узнайте об этой инновационной системе, которая включает в себя железнодорожные маршруты, региональные автобусные маршруты и новые транспортные средства.
GreenTruck предоставляет экологическую информацию о экологических требованиях к ремонту и техническому обслуживанию.
Простые экологические решения для сложной транспортной отрасли.
TransCycle выступает за экологичный подход к мировым транспортным проблемам.
В нем рассматриваются способы транспортировки, которые оказывают минимальное воздействие на окружающую среду с точки зрения потребления сырья, загрязнения и безопасности.
«Городское проектирование и планирование пригодных для жизни центров города».
Ежемесячный телесериал, информирующий пешеходов о вопросах безопасности.
Миссия Совета состоит в содействии инновациям и прогрессу в области транспорта путем стимулирования и проведения исследований, содействия распространению информации и поощрения внедрения результатов исследований.
ITRE проводит исследования, образование и проекты технической помощи по широкому кругу вопросов, связанных с наземным транспортом.
TransWeb служит хранилищем важной транспортной информации и воротами к ценным ресурсам по всему миру.
«Данные NPTS представляют собой единственный авторитетный источник характеристик личных поездок, особенно связанных с демографическими данными путешественников, для страны. Эти данные позволяют анализировать тенденции в поездках и относительное использование различных видов транспорта».
«Ваш полный брифинг о тенденциях, формирующих индустрию общественного транспорта.»
Программа улучшения модели поездок (TMIP) — это многолетняя межведомственная программа по разработке новых процедур моделирования спроса на поездки, которые точно и надежно прогнозируют поездки для широкого спектра видов транспорта. , действия политики и условия эксплуатации.
В состав ATU входят операторы автобусов, метро, легкорельсового транспорта и паромов, клерки, грузчики, механики и другие лица, работающие в сфере городского транспорта, дорожных и школьных автобусов, а также паратранзита персонал, техники скорой медицинской помощи, канцелярский персонал и муниципальные работники.
Мобилизует американцев, чтобы разорвать зависимость США от нефти.
Информация о ежегодном конкурсе велосипедов, который проводится в этом году в Ванкувере.
Transportation Alternatives — это поддерживаемая членами группа жителей Нью-Йорка, работающая над улучшением велосипедного движения, ходьбы пешком и общественного транспорта и сокращением количества автомобилей.
Ежеквартальный журнал, посвященный созданию устойчивых сообществ.
Служит потребностям общества, организуя и проводя междисциплинарные исследования по возникающим и важным транспортным проблемам, распространяя результаты этих исследований посредством конференций и научных публикаций, а также повышая качество и широту транспортного образования.
Наши программы поощряют и мотивируют людей ездить на велосипеде, ходить пешком, ездить на машине и чаще пользоваться общественным транспортом.
Содержит последние новости об исследованиях и разработках в железнодорожной отрасли.
Каталог транзитных ресурсов, доступных онлайн.
Их миссия состоит в том, чтобы сделать предоставляемые работодателем субсидии на проезд в общественном транспорте широко распространенной льготой для сотрудников.
Занимается инновационными исследованиями и анализом с целью разработки практических инструментов для учета социальных и экологических ценностей при принятии решений в области транспорта.
Работа над развитием индустрии легкорельсового транспорта в Северной Америке.
UrbanRail приглашает вас в путешествие по мировым метрополитенам, метро, тоннелям, U-Bahn и другим системам городского общественного транспорта.
Национальная организация, занимающаяся развитием растущего, устойчивого и прибыльного рынка автомобилей, работающих на природном газе.
Slower Speeds Initiative Исследования показывают, что снижение скорости является единственной наиболее эффективной мерой по сокращению выбросов углекислого газа автомобильным транспортом.
Сеть планировщиков — это ассоциация профессионалов, активистов, ученых и студентов, занимающихся физическим, социальным, экономическим и экологическим планированием в городских и сельских районах, которые способствуют фундаментальным изменениям в нашей политической и экономической системе. .
НТИ разрабатывает и реализует учебные и образовательные программы для работников общественного транспорта.
Охватывает все поездки по железной дороге, самолету, автобусу, парому, метро и трамваю в Великобритании (включая Нормандские острова, остров Мэн и Северную Ирландию) и между Великобританией и Ирландией .
Транспортные новости и статьи.
Transportation Choices Coalition хочет улучшить качество жизни жителей штата Вашингтон, включая чистый воздух и чистую воду, больше парков и живые и здоровые сообщества.
ELPC сотрудничает с другими экологическими организациями региона над созданием устойчивых транспортных систем, которые улучшают, а не ограничивают жизнь в наших городах и сельских районах.
TSC содействует разработке всех стандартов на транспорт и сопровождает их тестированием, обслуживанием, обучением и обучением.
«Организация, предоставляющая решения» в исследованиях, разработках и оценочных испытаниях транспортных и нетранспортных систем по всему миру.
Транспортный принцип: «Пересмотреть транспортные приоритеты, отдавая предпочтение пешеходам, велосипедам, тележкам и транспорту, а не автомобилям, и сделать акцент на «доступе через близость».
‘»
Исследует землепользование, транспорт, прогнозирование поездок и другие темы, связанные с городским планированием и устойчивым ростом.
«Для практичных и страстных велосипедистов… речь идет о городском велосипеде и культуре; разрастание и пригороды; устойчивость; политика, парадигмы, место; и планетарное сообщество.»
Один из десяти региональных научно-образовательных центров Национальной программы транспортных центров (UTCP).
Предоставляет информацию о нетрадиционных, инновационных транспортных технологиях.
Routes International служит воротами для перевозки людей любым видом транспорта по всему миру
Работа над продвижением механизированного транспорта, такого как ходьба и езда на велосипеде, с помощью звуковой инженерии и планирования.
«Больше людей чаще ездят на велосипедах.»
Выступает в качестве катализатора для улучшения транспортного образования на всех уровнях.
Организация, занимающаяся разработкой и администрированием политик, правил и услуг для наилучшего транспорта система для Канады и канадцев
Project ACTION способствует сотрудничеству между сообществом людей с ограниченными возможностями и транспортной отраслью
Группа защиты велосипедов с редакционными статьями, обзорами продукции, новостями для пригородных поездов и многим другим.
Работа над созданием и обеспечением доступа к разнообразной национальной сети профессионалов в области транспорта.
Новости и особенности общественного железнодорожного транспорта.