Ттн образец заполнения 2019: Транспортная накладная 2021 | Скачать бланк

Транспортная и товаротранспортная накладные \ Акты, образцы, формы, договоры \ Консультант Плюс

]]>

Подборка наиболее важных документов по запросу Транспортная и товаротранспортная накладные (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

Формы документов: Транспортная и товаротранспортная накладные

Судебная практика: Транспортная и товаротранспортная накладные Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Подборка судебных решений за 2019 год: Статья 14.17 «Нарушение требований к производству или обороту этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции» КоАП РФ
(ООО юридическая фирма «ЮРИНФОРМ ВМ»)Оценив представленные доказательства, в том числе договоры транспортной экспедиции и товарно-транспортные накладные, доводы лиц, участвующих в деле, руководствуясь положениями законодательства о лицензировании и законодательства о производстве, обороте этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции, установив, что заявитель не осуществлял хранение алкогольной продукции как самостоятельный вид деятельности, требующий лицензирования (равно как и производство, закупку, розничную продажу алкогольной продукции), в связи с чем, указав на отсутствие в его действиях события и состава вменяемого ему административного правонарушения, арбитражные суды правомерно отказали в привлечении к ответственности, предусмотренной ч. 3 ст. 14.17 КоАП РФ, за производство или оборот этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции без соответствующей лицензии. Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Подборка судебных решений за 2019 год: Статья 785 «Договор перевозки груза» ГК РФ
(ООО юридическая фирма «ЮРИНФОРМ ВМ»)Руководствуясь статьей 785 ГК РФ и оценив представленные в материалы дела доказательства (договор на оказание комплекса услуг по перевозке; акты отказанных услуг; платежные поручения; транспортные накладные; товарно-транспортные накладные; акт о невозможности проезда; заявление о зачете), арбитражные суды установили факт оказания истцом транспортных услуг ответчику, в связи с чем правомерно частично взыскали задолженность по договору оказания комплекса услуг по перевозке оборудования, признав, что ответчик частично нарушил сроки доставки грузов, при этом возможность проезда транспортных средств отсутствовала ввиду чрезвычайных и непредотвратимых при данных условиях обстоятельств — перекрытия дороги, о чем сторонами составлены совместные акты.

Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Транспортная и товаротранспортная накладные Путеводитель по договорной работе. Поставка. Рекомендации по заключению договора»При получении товара от перевозчика покупатель обязан проверить соответствие веса брутто и количества тарных мест сведениям, указанным в транспортных документах. При обнаружении повреждения тары (упаковки) товара, наличии признаков порчи товара и (или) при несоответствии товара сведениям, указанным в транспортных документах, покупатель обязан потребовать от перевозчика составления коммерческого акта, а при доставке груза автомобильным транспортом — отметки на товарно-транспортной накладной или составления акта».

Нормативные акты: Транспортная и товаротранспортная накладные

Транспортные накладные с 22 декабря 2019

Сегодня рассмотрим тему: «транспортные накладные с 22 декабря 2019 — 2020 года бланк и заполнение» и разберем основываясь на примерах. Все вопросы вы можете задать в комментариях к статье.

Новая транспортная накладная 2019 как заполнить печать нужна

Транспортные накладные с 22 декабря 2019 года: бланк и заполнение

• в разделе 13 нового бланка с 22 декабря следует указывать маршрут движения тяжеловесного или крупногабаритного транспортного средства либо транспортного средства, перевозящего опасный груз. До 22 числа – маршрут перевозки опасного, тяжеловесного или крупногабаритного груза;
• в разделе 15 с 22 декабря надо приводить стоимость услуг перевозчика и порядок расчета провозной платы за перевозку опасных грузов, грузов, перевозимых тяжеловесными и (или) крупногабаритными транспортными средствами. До 22 числа – за перевозку опасных, тяжеловесных и крупногабаритных грузов.

Нет видео.

Видео (кликните для воспроизведения).

.Такие же поправки внены в разделы 12 и 13 заказ-наряда на предоставление транспортного средстваВнести поправки в транспортные документы потребовалось в связи с тем, что чиновники приняли новую редакцию правил перевозок грузов автомобильным транспортом.

Кроме того, внесены уточнения в Постановление Правительства РФ от 24.12.2008 N 1007 “О сборе за проезд автотранспортных средств, зарегистрированных на территории иностранных государств, по автомобильным дорогам Российской Федерации”, в части определения веса грузовых автотранспортных средств иностранных перевозчиков в целях взимания сбора за использование автомобильных дорог Российской Федерации.Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Однако если одним транспортным средством осуществляется доставка груза нескольким грузополучателям, необходимо составлять накладную на партию груза для каждого грузополучателя отдельно.

По умолчанию транспортная накладная заполняется перевозчиком и грузоотправителем.

То есть форма документа составлена под условие, когда грузоотправитель и заказчик перевозки совпадают.

Форма заказа (заявки) Правилами перевозки не предусмотрена, но стороны вправе утвердить ее самостоятельно.

Правила заполнения товарно-транспортную накладную 2019 года

Точно также, если один и то же груз необходимо развести по разным фирмам, то на каждую партию необходимо составлять свой документ. Накладную условно можно поделить на две части: 1.

Первая – товарная, — включает сведения: • об отправителе и получателе товара, • объеме, • наименовании и т.п. параметры. Эта часть документа является основанием для списания груза со склада отправителя и одновременно для приходования его получателем.

2. Вторая часть – транспортная.

В ней содержатся сведения: • непосредственно о перевозке, • информация о компании-перевозчике и конкретном водителе, • марке автомобиля, • времени в пути и километраже, • товаре и т.д.

Транспортная накладная и удостоверяет факт наличия договора с поставщиком услуг по грузоперевозкам, отражает содержащиеся в нём данные, касающиеся груза, обязанностей сторон, нюансов перевозки, расходов и пр. Данный документ потребуется и в качестве отчётности при налоговой проверке, поэтому отнестись к правильности его заполнения следует внимательно, чтобы у представителей службы не возникло сомнений по поводу неактуального предоставления информации о движении денежных средств.

Нет видео.

Видео (кликните для воспроизведения).

Любые расхождения сведений в транспортных накладных с действительностью могут привлечь ненужное внимание налоговиков и повлечь за собой неприятные последствия в виде дополнительных начислений.

В железнодорожных перевозках используется транспортная ж/д накладная по форме ГУ-29-О, при авиаперевозках – грузовая накладная, а при доставке морским транспортом законность перемещения груза . При варианте доставки автомобильным транспортом с привлечением стороннего перевозчика в качестве доказательства договорённости сторон применяются:

Форма, порядок заполнения транспортной накладной утверждены постановлением Правительства РФ № 272 от 15 апреля 2011 г.

В указанном случае накладная должна быть составлена по утвержденной форме.

Давайте разберемся, как заполнить транспортную накладную, какие сведения стоит вносить в документ, какие правила действуют при его заполнении. Транспортная накладная для перевозок грузов автомобильным транспортом составляется на одну или несколько партий груза, перевозимых на одном автомобиле.

Необходимо обратить внимание на оформление транспортной накладной в случае, если груз, который необходимо перевезти, грузится на разные транспортные средства.

В таком случае документов заполняется несколько: количество накладных соответствует количеству автомобилей. Порядок оформления транспортной накладной, правила перевозок грузов автомобильным транспортом утверждены постановлением Правительства Российской Федерации от 15 апреля 2011 года № 272.

О том, для чего используется «Товарно-транспортная накладная», мы рассказывали в нашей .

Новой скорее можно назвать бланк транспортной накладной, который был утвержден позднее . Постановление Госкомстата от 28.11.1997 № 78, которым утвержден бланк ТТН, не содержит порядка заполнения формы.

Указывается лишь, что ТТН предназначена для учета движения ТМЦ и расчетов за их перевозки автотранспортом, что она состоит из 2 разделов (товарного и транспортного). Приводится также краткий порядок, описывающий назначение каждого из экземпляров товарно-транспортной накладной. Предполагается, что заполнение ТТН не должно вызывать особых сложностей у составителей.

Напомним, что форма № 1-Т не является обязательной к применению.

Печати на накладных отменили… Как быть, если все равно решили ставить?

Но если все-таки на накладных появится печать или штамп (ваши или контрагента) — все в порядке. В ТН или ТТН можно вносить дополнительную информацию, которая, по мнению организации, там необходима.

Именно к ней сейчас и относится печать или штамп.

При этом сейчас можно изменить место их проставления. Ведь где указывать дополнительную информацию, организация определяет сама.

Главное, чтобы оттиск не мешал прочтению иных записей в накладной .

Следует отметить, что у организации могут быть и свои причины все-таки «штамповать» накладные. К примеру, чтобы удостоверить подпись того или иного лица еще и печатью.

Что же делать, если организация все же хочет оставить такой реквизит на своих накладных? ТН и ТТН являются первичными учетными документами.

К тому же они включены в перечень Совмина, т.е.

организация не вправе вносить в форму таких документов какие-либо исправления. А Инструкция по их заполнению предусматривает лишь внесение дополнительных сведений.

С ее помощью имеется возможность списать товар в учете у продавца и поставить на учет покупателя. Еще она содержит информацию о перевозчике, как транспортная накладная (Приложение № 4 к Правилам перевозок грузов автомобильным транспортом).На основе ТТН отправитель списывает со своего баланса отправляемые ценности, а получатель наоборот, вносит их на баланс. Посмотрите, в каких случаях можно оформить поставку товара товарно-транспортной накладной, где взять ТТН нового образца 2019 и скачать бланк в Excel, как она правильно составляется.

А удобный образец заполнения поможет быстро разобраться.Документ-сопровождение оформляется, если страна отправителя или получателя ратифицировала Конвенцию от 19. 05.1956 в части договора о международных автомобильных грузоперевозках. Нормы Конвенции закрепляют правила и порядок, по которому осуществляются перевозки автомобильным транспортом, в том числе и для государственных (муниципальных) учреждений (п.

Образец заполнения транспортной накладной (Приложение 4)

Прием груза Сдача груза Прием груза: 430000, г. Саранск, ул. Большевистская, д.

18; 06.07.2017, 10-00 – дата и время подачи транспортного средства; 06.07.2017, 10-00 – прибытия; 12-00 — убытия.

Грузовых мест – 28; Масса груза — 175 кг. Водитель — Потапов Василий Николаевич Сдача груза: 426033, г. Ижевск, ул. Партизанов, д. 171 11.07.2017, 15-00 – дата и время подачи транспортного средства; 11.07.2017, 15-00 – прибытия; 12-00 — убытия.

В соответствии с 5.2. статьи 175 Гражданского Кодекса РФ «Договор перевозки груза», «Заключение договора перевозки груза подтверждается составлением и выдачей отправителю груза транспортной накладной (коносамента или иного документа на груз, предусмотренного соответствующим транспортным уставом или кодексом)». Таким образом, заполненная и подписанная обеими сторонами транспортная накладная – это документ перевозки, относимый к разряду первичных, подтверждающий ратификацию договора на транспортировку груза силами грузоперевозчика.

Движение груза, как правило, оформляется грузосопроводительными и транспортными документами. Большая часть перевозимых товаров доставляется получателю автомобильным транспортом. Перевозки автотранспортом регламентируются федеральным законодательством, а именно «Уставом автомобильного транспорта и городского наземного электрического транспорта» от 08.11.2007 г. за номером 259. В соответствии со статьей 8 этого документа, транспортная накладная является основанием для оплаты за произведенную перевозку, оформление ее обязательно.

Накладная заполняется грузоотправителем и передается перевозчику вместе с грузом. Данный документ должен находиться у водителя транспортного средства и предъявляться сотрудникам Госавтоинспекции при остановке автомобиля для проверки. Кроме того, накладная служит основанием для возможного требования неустойки при потере или порче перевозимого товара, так как в ней содержатся данные о наименовании товара, его количестве в местах, килограммах.

Учитывая письмо ФНС за № ЕД-4-3/4681 от 21.03.2012 г., транспортная накладная (ТН) доказывает расходы компании, понесенные в процессе перевозки при условии ее корректного заполнения, включая внесение данных о регистрационных номерах транспортных средств. До 2011 года при перевозке груза автомобильным транспортом заполнялась товарно-транспортная накладная на специальном бланке формы № 1-Т. Постановлением Правительства № 272 15.04.2011 г. была введена в оборот новая транспортная накладная, действующая в настоящее время.

Транспортная накладная, форма 272: правила заполнения

Форма ТН определена Приложением № 4 к «Правилам перевозок грузов автомобильным транспортом» в редакции от 12 декабря 2017 г. с изменениями, внесенными 16 марта 2018 г. Заполнение документа регламентируется II разделом Правил. ТН оформляет грузоотправитель в случае транспортировки груза сторонней транспортной компанией. Документ не является основанием для оприходования или списания товара.

Правила заполнения транспортной накладной в 2019 году:

• оформляется в трех оригинальных экземплярах для сторон-участников операции – перевозчика, отправителя, получателя;
• выдается в копиях на каждый автомобиль, участвующий в перевозке;
• если доставка нескольких партий товара осуществляется одним транспортным средством, допускается внесение данных об этом грузе в один бланк;
• удостоверяется печатями и подписями отправителя с одной стороны и перевозчика с другой;
• изменения, которые могут вноситься в процессе заполнения, заверяются подписями и печатями сторон в обязательном порядке;
• в строке 1, 2 отмечаются данные сторон с указанием средств связи;
• 3 – наименование перевозимого груза;
• 4 – документы на груз сопровождающего характера: накладные, сертификаты, счета-фактуры;
• 5 – наименование средства транспортировки;
• 6,7 – точные адреса, по которым должен быть доставлен груз и адрес отправителя, уточняющие данные о наличии маркировки, спецупаковки, вес, дата отправки/прибытия груза, подпись водителя;
• 8 – правила перевозки заполняются уточняющими данными;
• 9 строка оформляется датой приемки груза транспортной компанией с указанием ФИО приемщика и его подписи;
• на обратной стороне бланка в графе 15 необходимо указать плательщика;
• ТН, оформляемая не директором предприятия, требует указания доверенности, выписанной на уполномоченного сотрудника;
• 16 строка предназначена для окончательного визирования документа подписями и печатями сторон;
• строка «объявленная стоимость» заполняется в случае особой ценности груза.

Образец оформления ТН представлен на рисунке ниже:

Товарно-транспортная накладная: правовые особенности

Форма ТТН – 1-Т введена в оборот 28.11.1997 г. постановлением Госкомстата РФ за № 78 в качестве первичного документа по учету работ автотранспорта. ТТН – это синтез 2-х документов (товарная накладная плюс транспортная), удостоверяющий сделку по отправке и перевозке груза и понесенных при этом мероприятии расходов. В соответствии с рекомендациями по оформлению бланка ТТН, форма служит для фиксации транспортировки товарно-материальных ценностей автотранспортом, а также производимых при этом расчетов.

Форма 1-Т до 25 июля 2011 г. применялась в случаях привлечения к транспортировке товара независимого грузоперевозчика, формировалась в 4-х экземплярах: по одному для получателя и отправителя, 2 экземпляра передавались перевозчику. Новая транспортная накладная формы 272 не отменяет товарно-транспортную формы 1-Т. Более того, товарная накладная формы ТОРГ-12, утвержденная 25. 12.1998 г. Постановлением Госкомстата России за № 132, также правомочна. Таким образом, в обращении находятся накладные трех видов, что подтверждается письмом Минтранса РФ за № 03-01/08-1980ис от 20.07.2011 г.

Можно предположить, что количество документов, заполняемых на перевозку, является избыточным, и существуют ситуации, когда из операции по сделке может быть исключен тот или иной документ. Состав пакета накладных зависит от наличия договора на транспортировку.

Если покупатель – юридическое лицо – не является плательщиком за доставку, он в своих учетных операциях применяет ТТН 1-Т или ТН № ТОРГ – 12. Такой порядок определен письмом Минфина России № 03-03-06/1/413 от 15.06.2010г. Это письмо издано до 25.07.2011 г., то есть ТТН до указанной даты необходимо было оформлять в случае трехсторонней сделки с участием перевозчика, отправителя и получателя груза.

Таким образом, ТТН на сегодняшний день необходимо оформлять в рамках условий договора перевозки, поставки, купли-продажи, а также внутренних правил, действующих в компании. Как правило, порядок оформления и перечень транспортных документов компания, поставляющая товар, определяет договором поставки в соответствующих приложениях.

При доставке товара автотранспортом поставщика за счет покупателя, то есть, когда оплата транспортных расходов производится покупателем, документами, подтверждающими расходы, следует считать:

• акт оказания услуг от поставщика;
• товарную накладную с пометкой стоимости транспортных расходов;
• ТН 1-Т или накладную по форме договора поставки, формы 272 или путевым листом/талоном путевого листа 4-П.

В случае включения транспортных расходов в стоимость товара потребуется только накладная на него по форме ТОРГ-12 или М-15. Такой порядок определен письмом Министерства Финансов РФ за № 03-03-10/123 от 22.12.2011 г., регулирующим гражданско-правовые отношения отправителя и получателя в рамках оказания услуг по транспортировке товара по договору поставки.

ТН формы 272 отличается от ТТН тем, что в ней отсутствуют признаки, по которым этот документ мог бы являться основанием постановки товара на склад покупателя для его дальнейшего оприходования, а для продавца – основанием для списания.

В 3-м пункте ТН имеются данные о перевезенном товаре, но их недостаточно для идентификации для последующего бухгалтерского и налогового учетов. Например, не проставляется цена единицы товара по договору поставки, так же, как общей стоимости товара, перевезенного по накладной. Строка 5 отражает объявленную стоимость, не превышающую объявленную стоимость товара, этой информации достаточно для определения возможного ущерба. Не исключено, что суммы могут разниться – раздел II Правил п. 12.

ТН – документ учета движения товаров и транспортных затрат между двумя сторонами договора поставки – грузоотправителем и грузополучателем. ТТН – основной документ для оприходования товара покупателем и снятия с учета поставщиком, тогда как ТН удостоверяет договоренность на транспортировку груза.

Товарно-транспортная накладная включает в себя 2 раздела: транспортный и товарный, состоящие из таблиц, представлено на рисунке ниже:

Документы также имеют различия в количестве заполняемых экземпляров: ТТН оформляется в 4-х единицах, для ТН – достаточно 3-х.

В 2019 году Министерство транспорта РФ планирует ввести в оборот электронные транспортные накладные – ЭтрН. Это решение вызвано необходимостью упрощения замысловатого документооборота, существующего в отрасли грузоперевозок на территории России.

В визировании электронных документов будут задействованы все участники транспортной сделки: отправители, получатели, транспортные компании и предприятия, осуществляющие логистику – распределительные центры. Компании – стороны договора поставки зачастую находятся на значительном удалении друг от друга и выбирают обмен сканированными первичными документами по электронной почте, заверенными факсимиле. Известно, что эти копии не могут представлять интересы сторон при возникающих разногласиях, так как юридически не значимы.

Остались вопросы? Узнайте, как решить именно Вашу проблему – позвоните прямо сейчас:

+7 (499) 577-03-71
(Москва)

+7 (812) 425-60-36
(Санкт-Петербург)

8 (800) 333-58-23
Для всех регионов!

Это быстро и бесплатно!

По выводам экспертов, занимающихся вопросом перехода на электронный документооборот, новое решение значительно ускорит процесс обмена документами, а значит расчетов по сделкам. Стороны получат возможность снизить затраты на обработку и хранение корреспонденции, повысив юридическую значимость документов. Существенным преимуществом новинки станет возможность представления документов в проверяющие органы.

Тестирование возможностей электронного документооборота доказало его правомочность и потенциал в ответ на возникающие требования транспортной отрасли и уже вполне созрело для активного применения в транспортировании грузов с использованием автомобильного транспорта, так как:

• документы доставляются до адресата мгновенно;
• накладные не теряются в пути;
• согласование занимает несколько минут;
• юридическая значимость подтверждена;
• распечатывать накладные не требуется;
• для предоставления в ФНС документ выгружается мгновенно;
• водитель может пользоваться документом через Viber;
• снижаются затраты на хранение первичной документации;
• клиенты получают возможность следить за транспортировкой онлайн;
• по окончании маршрута есть возможность обменяться документами мгновенно;
• минимизируется зависимость от человеческого фактора и ресурса.

Транспортная накладная — бланк 2019, образец заполнения

Одним из главных документов при перевозке товара в торговле является транспортная накладная. Данный вид участвует в хозяйственной деятельности организаций. Он заполняется по факту договора, имеет общую унифицированную форму, находится в открытом доступе. Образец обновляется по мере внесения изменений. Компании могут разработать документ самостоятельно, главное оставить необходимые разделы.

Актуальный бланк Транспортной накладной 2019 — качайте в конце статьи.

Согласно Гражданскому кодексу, транспортная накладная — документ, который подтверждает перевозку товара между контрагентами. ТН заключается на основании договора между субъектами. Продавец обязуется доставить товар в оговоренный пункт назначения, а покупатель оплатить за груз.

Образец содержит положения о перевозке груза автомобильным средством.

Обязательно нужно указать информацию о грузоотправителе:

1. Адрес
2. Наименования
3. Место нахождения
4. Мобильный номер
5. Банковские реквизиты

Аналогичные сведения оформляются о грузополучателе. Должно быть зафиксировано наименование товара, который отправляется, его масса нетто и брутто, размер, количество мест. К транспортной накладной прикрепляются сопроводительные документы, например:

1. Параметры автомобиля
2. Объявленная стоимость груза
3. Необходима температура
4. Объем
5. Данные о запорно-пломбировочных устройствах

Указывается следующая информация:

1. Сведения о сдаче товара к выгрузке
2. Сведения о принятии заказа к исполнению
3. Информация о перевозчике и транспортном средстве
4. Отражается цена перевозки
5. Указывается порядок расчета за услуги
6. Описывается фактическое состояние груза, упаковка

Основной документ регламентирует условия при грузоперевозке, а не характеризует груз. О товаре указывается лишь общая информация. Передача бланка в пункте разгрузки водителем является подтверждение того, что договор выполнен и услуги оказаны. Договор может оформляться руководителем компании, которая оказывает транспортные услуги.

Инспекторы ГИБДД во время следования груза проверяют документы, так как они подтверждают правомерность перевозки автомобилем. ВАЖНО! Бланк имеет юридическую силу, если стоит все подписи.

Накладную необходимо составить в следующих случаях:

1. Товар доставляется покупателю через экспедитора. Он в свою очередь заключает договор перевозки.
2. Товар доставляется перевозчиком. Имеется договор перевозки.

В случае если покупка осуществляется со склада, то документ составлять не нужно.

С правилами заполнения можно ознакомиться во втором разделе требований о перевозке грузов транспортными средствами. Основные положения:

• Бланк можно составить на несколько партий перевозимых на одном автомобиле.
• Груз, который перевозится на разных транспортных средствах, должен сопровождаться отдельной накладной. Документы должны соответствовать числу автомобилей.
• В незаполненных строках нужно поставить прочерк.
• Транспортная накладная должна быть оформлена в трех экземплярах.
• Документы распределяются между продавцом, покупателем, грузоперевозчиком.
• Объявленная стоимость груза от отправителя не должна быть больше фактической цены.

Если компания хочет составить свой собственный бланк нужно предварительно ознакомиться с образцом. Основные положения должны быть зафиксированы, иначе документ не имеет юридической силы.

• В 13 разделе обязательно указать маршрут движения
• В разделе 15 привести стоимость услуг грузоперевозчика, а так же указать расчет оплаты, если груз относится к категории опасных или перевозится тяжеловесным, крупногабаритными средствами.

ВАЖНО! Документы выписываются грузоотправителем, но оформлением может заниматься и другое лицо в рамках договора. Транспортная компания заполняет бланк в офисе компании, и передает его водителю ТС. Он отвозит грузоотправителю, когда выезжает за товаром для доставки.

Шаблон включает 17 разделов. Форма бланка устанавливается Правительством. Документ заполняется в трех экземплярах и передается перевозчику, получателю и отправителю. Можно внести информацию от руки или на компьютере.

Согласно действующему законодательству при проведении хозяйственных операций между контрагентами должна быть оформлена соответствующая документация. Если не соблюдать данное требование лицо привлекут к административной ответственности. ТН — это один из важнейших документов, который подтверждает наличие заключенного договора на перевозку товара. Бланк регулирует осуществление движения груза и является основанием при расчете.

Чем Товарно-Транспортная Накладная отличается от ТН?

Ранее использовалась только товарно-транспортная накладная. Сейчас активно применяются два документа: транспортная накладная и товарно-транспортная накладная. Возникает вопрос: «Какая разница между двумя видами документов?»

Для чего нужна товарно-транспортная накладная и ее основные особенности:

• Необходима при учете движения груза между отправителем и получателем.
• Является подтверждающим документом при перевозке товара по дороге.
• Состоит из разделов: транспортный и товарный. В каждый раздел заносится информация о грузе, фиксируются этапы перевозки.
• ТН — основание при расчете за перевозку.
• Составляется в четырех экземплярах.
• Позволяет списать товар продавцу и оприходовать его у покупателя.

Для чего нужна транспортная накладная и ее основные особенности:

• Является основанием заключения договора перевозки.
• Состоит из транспортного раздела. В нем заключена информация о продавце, покупателе и перевозчике. Зафиксированы условия грузоперевозки и факты транспортировки товара.
• Правомерность для осуществления перевозки.
• Нет номера юридических лиц, а именно продавца и покупателя. Записан только номер ответственного за груз.
• Указаны сведения о таре: упаковка, маркировка, грузовые места, масса и размер товара.
• Указаны требования отправителя о машине, условиях доставки, состоянии груза, упаковке, таре.
• Нет информации о плательщике, конкретно: наименования, банковского реквизита, адреса.
• Является основанием для подтверждения расходов за перевозку транспортным средством.
• Бланк нельзя использовать основанием для оприходования товарно-материальных ценностей получателем и списания продавцом.
• Заполняется в трех экземплярах.
• В товарной накладной не указана цена за единицу, нет общей стоимости груза. Можно заполнить только объявленную стоимость.
• Документ предъявляется для расчета за оказанные услуги.

Если бухгалтером оформляется транспортная накладная, то для списания и оприходования товара можно оформить товарную накладную. Данный документ содержит сведения о цене товара, количестве и наименование. Если бланк отсутствует, то грузоотправитель не сравнит груз, который он получил с фактически отправленным.

Налоговые инспекторы не смогут проверить основания для вычета налога НДС покупателем, соответственно без накладной не удастся признать транспортные расходы при расчете налога на прибыль.Если оформление товара производится со склада, то выдается путевой лист. Для принятия груза на учет будет достаточно товарной накладной ТОРГ 12.

На первый взгляд может показаться, что один документ заменяет другой, однако это не так. Товарно-транспортная накладная заполняется более полными данными, есть два раздела, один из которых предназначен для учета. Некоторые специалисты считают, что документы определяют сферу применения. Транспортная накладная оформляется, если в перевозке участвует транспортная компания, а товарно-транспортная накладная, если перевозчиком является отправитель или получатель. Однако в случае если перевозчиком становится поставщик или покупатель документы могут не потребоваться.

При заключении договора можно использовать один из этих документов. Налоговая служба признает оформление двух бланков избыточным. Для того чтобы подтвердить транспортные затраты можно применять транспортную накладную или товарно-транспортную.Транспортная накладная регулирует перевозку и порядок доставки груза. В ней не указаны сведения о стоимости доставленного груза.

Заполнять бланк нужно согласно правилам перевозки грузов автомобилями. Разделы содержат простую и понятную нумерацию, каждый из которых имеет свое назначение, название. Рядом с графой изложены требования. Необходимо помнить, что число ТН будет зависеть от использованных при перевозке транспортных средств. Каждый автомобиль должен быть сопровожден отдельной транспортной накладной.

ВАЖНО! Один документ может быть заполнен на несколько партий грузов, но только если товар его от одного отправителя к одному покупателю.

Если перевозка сборная, то на отдельные партии груза оформляются отдельные накладные.Компании должны уделить особое внимание при выдаче сопроводительных документов. Только правильно оформленные бланки являются основанием при признании транспортных расходов. Бухгалтера должны следить за изменения в законодательстве.

Обязательные реквизиты — подписи и печати сторон: перевозчика, грузоотправителя, получателя. Чтобы избежать разногласия лучше максимально заполнить все разделы. В незаполненных полях поставить прочерк.

Бланк транспортной накладной 2019 word (Размер: 107,0 KiB | Скачиваний: 120)

Бланк накладной в excel (Размер: 78,5 KiB | Скачиваний: 91)

Новая товарно-транспортная накладная: скачать бланк и образец заполнения на 2019 год

Товарно-транспортная накладная — это документ, который применяют при учете движения ТМЦ и расчетах за их перевозку автотранспортом. В статье вы найдете новый бланк ТТН в форматах word и excel, а также образец его заполнения, актуальный на 2019 год.

ТТН по форме 1-Т потребуется грузоотправителю при списании, а грузополучателю при оприходовании ТМЦ, перевозимых автотранспортом. Также можно использовать транспортную накладную. Скачайте бланки этих документов и образцы их заполнения:

Данную форму применяют при учете движения ТМЦ и расчетах за их перевозку автомобильным транспортом. Госкомстат утвердил этот документ 28 ноября 1998 года приказом № 78.

Бланк включает в себя шапку и два раздела:

1. Товарный раздел. Он содержит информацию о взаимоотношениях грузоотправителя и грузополучателя. Реквизиты позволяют грузоотправителю списать, а грузополучателю оприходовать ТМЦ.

1. Транспортный раздел. Предназначен для указания информации о взаимоотношениях грузоотправителя – заказчика перевозки с юрлицами – владельцами автотранспорта, которые осуществляют перевозку. Реквизиты раздела необходимы для учета затрат на доставку.

Перевозчику форма служит подтверждением факта оказания транспортных услуг. На основании накладной водителям начисляют зарплату.

Заполнение формы ТТН начинают с шапки. В поле «Плательщик» вписывают информацию о грузополучателе (покупателе). Поле «Заказчик (плательщик)» заполняют данными о лице, заказавшем перевозку.

В товарном разделе в поле «Плательщик» вписывают реквизиты покупателя, грузополучателя товара.

В транспортном разделе в поле «Заказчик (плательщик)» указывают реквизиты заказчика перевозки. Им может являться как отправитель груза, так и его получатель. Например, когда услуги по перевозке согласно договору поставки оплачивает продавец товара, в графу вписывают его реквизиты. Когда покупатель — его данные.

Форму ТТН заполняет работник фирмы-грузоотправителя. Подписи на ней ставят:

• работник, ответственный за отгрузку;
• работник, который произвел отгрузку;
• главный бухгалтер.

Также на бланке ставят печать юридического лица.

Со стороны перевозчика документ подписывает работник, который принял ТМЦ к перевозке.

Количество составляемых экземпляров зависит от вида груза:

1. На грузы товарного характера составляют четыре экземпляра:

• первый предназначен для отправителя груза;
• второй – получателю для оприходования груза.
• третий и четвертый – перевозчику (один экземпляр от прилагает к счету за перевозку и высылает заказчику автотранспорта, второй использует в качестве приложения к путевому листу).

На третьем и четвертом экземплярах со стороны грузополучателя свою подпись ставит работник, непосредственно принявший ТМЦ. На бланке также ставят печать организации – получателя.

1. На грузы нетоварного характера оформляют три экземпляра:

• первый и второй предназначены для перевозчика
• третий – для грузоотправителя.

Приведем образец заполнения ТТН в 2019 году:

Бланк транспортной накладной Правительство РФ утвердило постановлением от 15.04.2011 № 272. Его используют при оформлении доставки грузов автотранспортом.

Если договор перевозки не предусматривает иные условия, то оформлением транспортной накладной владелец груза или его отправитель подтверждает заключение этого договора.

Когда покупатель организует доставку ТМЦ собственными силами, транспортную накладную можно не составлять (письмо Минфина от 22.12.2011 № 03-03-10/123).

Документ оформляют в трех экземплярах. Они необходимы перевозчику, грузоотправителю и грузополучателю.

Накладную можно оформить на одну или несколько партий грузов, перевозимых на одном автомобиле.

Грузоотправитель и перевозчик, либо их уполномоченные лица, ставят свои подписи на каждом экземпляре документа.

Транспортная накладная играет роль первичного учетного документа для целей бухгалтерского и налогового учета. Он подтверждает расходы, понесенные по договору перевозки. При этом в документе должна быть указана стоимость. В противном случае, подтверждается только факт перевозки (письмо ФНС от 10.08.2018 № АС-4-15/15570).

Бланк транспортной накладной содержит 17 разделов. Рассмотрим на примере заполнения для чего они предназначены:

• для информации о грузоотправителе и грузополучателе;

Обратите внимание: при отгрузке ТМЦ со склада филиала или обособленного подразделения нужно указывать наименование и адрес головного офиса отправителя. Филиалы и обособленные подразделения не являются юрлицами. Стороной по договору перевозки выступает головной офис.

• стоимости услуг перевозки;

• адресах мест погрузки и выгрузки ТМЦ;

Обратите внимание: прочерки в разделе 8 означают, что указанные в нем условия определяются по общим правилам. Они установлены Законом от 08.11.2007 № 259-ФЗ.

Товарно-транспортную накладную можно не составлять при наличии транспортной накладной. Унифицированная форма № 1-Т не является обязательной.

Более того, вопрос о том, какую применять форму решает руководитель. Бланк можно разработать самостоятельно и утвердить приказом к учетной политике. При этом бланк должен содержать все необходимые реквизиты, установленные для первички.

Автор статьи: Филипп Соловьев

Здравствуйте! Я Филипп, уже более 12 лет занимаюсь юриспруденцией. Я считаю, что являюсь профессионалом в своей области и хочу подсказать всем посетителям сайта как решать разнообразные задачи. Все материалы для сайта собраны и тщательно переработаны с целью донести как можно доступнее всю нужную информацию. Однако чтобы применить все, описанное на сайте – всегда необходима консультация со специалистами.

✔ Обо мне ✉ Обратная связь Оцените статью: Оценка 3.9 проголосовавших: 16

КОНСУЛЬТАЦИЯ ЮРИСТА

УЗНАЙТЕ, КАК РЕШИТЬ ИМЕННО ВАШУ ПРОБЛЕМУ — ПОЗВОНИТЕ ПРЯМО СЕЙЧАС

8 800 350 84 37

Правила Оформления Товарнотранспортной Накладной 2019

Вернули цены на БухСофт года — только на 2 дня. Этот документ спасет от обидных штрафов и защитит от ошибок. Актуальность подтверждена экспертами программы БухСофт. Зарегистрируйтесь, скачайте и сразу используйте в работе! В статье — все про заполнение товарно-транспортной накладной в году. Также вы найдете актуальный бланк ТТН, информацию об особенностях ее применения в учете и бесплатные справочники по учету.

ВИДЕО ПО ТЕМЕ: Международная транспортная накладная. Как правильно заполнить CMR

Дорогие читатели! Наши статьи рассказывают о типовых способах решения юридических вопросов, но каждый случай носит уникальный характер.

Если вы хотите узнать, как решить именно Вашу проблему — обращайтесь в форму онлайн-консультанта справа или звоните по телефонам, представленным на сайте. Это быстро и бесплатно!

Транспортная накладная 2021: скачать бланк, образец заполнения

С 25 июля года при перевозке грузов по территории России применяется транспортная накладная. А с 1 января года действует новая форма этого документа. На этой странице — транспортная накладная на Скачать бланк и образец заполнения документа здесь вы можете бесплатно. Далее читайте, что поменялось в накладной и как теперь ее оформлять. Зарегистрируйтесь в онлайн-сервисе печати документов МойСклад, где вы совершенно бесплатно сможете:. В форма транспортной накладной изменилась. Действует новая редакция правил перевозки грузов автотранспортом постановление Правительства от Теперь они регулируют грузоперевозки тяжеловесными или крупногабаритными транспортными средствами а не транспортировку тяжеловесных или крупногабаритных грузов, как раньше.

Вместе с правилами обновились и формы соответствующих документов. В разделе 13 транспортной накладной теперь указывается маршрут движения тяжеловесного, или крупногабаритного, или перевозящего опасный груз транспорта. Аналогичные изменения — в разделе Теперь в нем приводится стоимость услуг перевозчика и порядок расчета платы за перевозку опасных грузов или грузов, перевозимых тяжеловесным или крупногабаритным транспортом.

Как заполнить транспортную накладную? Образец с измененными разделами — ниже. До введения транспортной накладной ТН применялся другой документ: товарно-транспортная накладная ТТН. Однако после того, как в практику вошла первая, отмены второй не произошло. В чем разница между ними? В форма транспортной накладной заполняется в соответствии с обновленными Правилами перевозки грузов:. Хотите забыть о проблемах с оформлением новой транспортной накладной раз и навсегда? Интернет-сервис МойСклад специально для вас разработал систему автоматического заполнения и печати всех необходимых бухгалтерских документов.

Для работы с ним вам потребуется только компьютер с принтером и доступ в интернет. И вы сможете оформлять и печатать документы в любое время суток и из любого места, где бы вы ни находились. В общем случае — грузоотправитель, если иное не предусмотрено договором перевозки. Но это может быть неудобно, так как отправитель, заполнив свою часть документа, должен будет передать оригинал водителю вместе с грузом. Тот, вместо того чтобы везти товар напрямую получателю, должен будет сначала съездить в офис компании-перевозчика с транспортной накладной, чтобы ее заполнили ответственные лица.

И только после этого водитель займется доставкой груза. Удобнее предусмотреть в договоре, что транспортную накладную оформит грузоперевозчик. Тогда транспортная компания заполняет свою часть бланка в своем офисе, оригинал передается водителю, и тот отвозит его грузоотправителю, выезжая за грузом. В чем разница — читайте выше. Вкратце: ТТН содержит сведения о товаре, необходимые для списания и оприходования, что избавляет от необходимости выдавать форму ТОРГ Однако в ТН больше детальных сведений о транспортировке груза.

Какой документ выдавать — зависит от конкретной ситуации:. Скачайте другие унифицированные формы. Формы документов. Транспортная накладная скачать бланк, образец заполнения. Новый бланк накладной на перевозку груза Скачать бланк. Зарегистрируйтесь в онлайн-сервисе печати документов МойСклад, где вы совершенно бесплатно сможете: Скачать бланк транспортной накладной Заполнить и распечатать документ онлайн это очень удобно На этот адрес будет отправлен пароль для доступа к сервису.

Регистрируясь в сервисе МойСклад, вы принимаете условия договора-оферты. В ней есть необходимая информация о товаре: цена за единицу, количество и наименование. Зарегистрируйтесь в онлайн-сервисе печати документов МойСклад, где вы совершенно бесплатно сможете: Скачать список товаров, которые можно продавать на карантине, и другие нормативные акты по работе бизнеса Скачать полный список пострадавших от коронавируса отраслей и таблицу с новыми сроками уплаты налогов Заполнять и печатать документы онлайн — это очень удобно На этот адрес будет отправлен пароль для доступа к сервису.

При транспортировке опасных грузов или при использовании крупногабаритного или тяжеловесного транспорта в пункте 13 при необходимости указываются сведения о маршруте следования, а также о номере, дате и сроке действия специального разрешения. Скачать образец. Скачать бланк накладной на перевозку груза Скачать бланк. Более 1 компаний уже печатают счета, накладные и другие документы в сервисе МойСклад Начать использовать.

Другие формы Бланк товарной накладной. ТОРГ — Товарная накладная. Расходная накладная. Приходная накладная. Накладная на отпуск товара ОП Читайте также Наименование товара в чеке онлайн-кассы.

Маркировка одежды. Маркировка постельного белья и других видов текстиля. Штрафы за нарушения по онлайн-кассам в году. Как зарегистрировать онлайн-кассу в налоговой. МойСклад — торговля, склад и CRM в облаке Всё, что нужно, в одной системе: продажи, закупки, склад, финансы, клиенты и поставщики Начать использовать.

Правила заполнения ТТН в 2020 году

Зинаида Омельницкая. Операции, связанные с эксплуатацией автомобиля, как и любые другие хозяйственные операции, должны быть зафиксированы первичными документами. Какими именно первичными документами следует оформлять работу автотранспорта, мы расскажем в консультации. Начнем с анализа правил заполнения товарно-транспортной накладной далее — ТТН.

С 25 июля года при перевозке грузов по территории России применяется транспортная накладная. А с 1 января года действует новая форма этого документа. На этой странице — транспортная накладная на

С 12 июля ТТН можно составлять в электронном виде. То есть это альтернатива бумажным вариантам. Хотя вовсе без бумаги не обойтись. Итак, о деталях использования и заполнения электронной ТТН речь пойдет далее. Мининфраструктуры приказом от

Электронная ТТН: правила использования и составления

При этом напомним, что ТТН можно оформлять и без точного соблюдения формы, приведенной в приложении 7 п. Главное — чтобы в ней были все обязательные реквизиты, которые названы в п. Изменено само определение ТТН. А вот для учета ТМЦ: их оприходования, списания, складского, оперативного и бухгалтерского учета ТТН может использоваться только в качестве одного из! Как говорится, лучше поздно, чем никогда. Хотя в последнее время не без помощи судебной практики их мнение в этом вопросе устоялось — фискалы все-таки стали говорить см. Иначе говоря, при отсутствии ТТН налоговики могут не признать только расходы по перевозке. При этом само по себе отсутствие ТТН не должно лишать предприятие права на расходы в сумме стоимости приобретенных ТМЦ. Общую ТТН т.

ТТН-новшества: обновленная форма и возможность составлять в электронной форме

Товарно-транспортная накладная ТТН предназначена для учета движения товарно-материальных ценностей и расчетов за их перевозки автомобильным транспортом. Товарно-транспортная накладная на перевозку грузов автомобильным транспортом составляется грузоотправителем для каждого грузополучателя отдельно на каждую ездку автомобиля с обязательным заполнением всех реквизитов. Согласно п. Постановления Госкомстата России от 28 ноября г. Товарного, определяющего взаимоотношения грузоотправителей и грузополучателей и служащего для списания товарно-материальных ценностей у грузоотправителей и оприходования их у грузополучателей.

Основные постулаты документального оформления использования автомобильного транспорта в деятельности субъектов хозяйствования описаны в Законе об автотранспорте. Как видим, ст.

Наводите курсор на соответствующую графу товарно-транспортной накладной для получения нужной информации. Обратите внимание, что Приказом Министерства инфраструктуры Украины от В связи с этим обязательные поля ТТН будут отмечены красным цветом.

Товарно-транспортная накладная

Дата публикации Организация приобретает товар, доставку которого оплачивает продавец. Доставляет товар транспортная компания. Кого указывать в строке «Плательщик» в ТТН форма 1-Т — покупателя товара или заказчика услуги по перевозке продавец?

.

Товарно-транспортная накладная (ТТН, форма 1-Т)

.

Правил в ТТН можно заменить графу “Автомобильный перевозчик” на к ТТН должны быть оформлены по общим правилам оформления ТТН.

.

.

.

.

.

.

.

С 1 октября изменяются правила оформления ТТН

С 1 октября 2021 года в Украине вводятся изменения порядка оформления товарно-транспортной накладной (ТТН), согласно которым при ее оформлении грузоотправитель будет обязан указывать транспортное средство и его параметры (длину, ширину, высоту, общий вес, в том числе с грузом, и массу брутто). Эти изменения вносятся Законом Украины «О внесении изменений в некоторые законы Украины относительно отдельных вопросов осуществления габаритно-весового контроля» № 1534-IX от 3 июня 2021 г. в ст. 48 Закона Украины «Об автомобильном транспорте» № 2344-III от 5 апреля 2001 года.

Однако, Министерством инфраструктуры Украины до сих пор не внесены соответствующие изменения в приказ «Об утверждении Правил перевозок грузов автомобильным транспортом в Украине», в котором приведена форма товарно-транспортной накладной. Правилами определено, что субъекты хозяйствования имеют право оформлять ТТН без соблюдения этой формы, при условии наличия в ней обязательных реквизитов. При этом, Мининфраструктуры не предоставляет разъяснений, как указывать новые реквизиты тем предприятиям, которые используют форму, приведенную в Порядке.

Считаем, что ТТН, заполненная без весово-габаритных показателей, для целей бухгалтерского учета не теряет своей силы.

По поводу этого нововведения Европейская Бизнес Ассоциация обратилась к премьер-министру и главе профильного комитета ВРУ с просьбой пересмотреть это требование и отменить обязательное указание упомянутых параметров транспортного средства.

Как отмечают эксперты Ассоциации, обязанность оформлять ТТН возложена на грузоотправителей, но поскольку последние пользуются транспортными услугами других компаний, то в основном не имеют информации о параметрах транспортного средства перевозчика. А, следовательно, не могут проверить такие данные и гарантировать их корректность при внесении в накладную. В связи с этим, у компаний-членов Ассоциации возникают вопросы, какая погрешность в занесенных в ТТН значениях параметров транспортного средства является допустимой.

На практике у бизнеса нет баз данных, содержащих такую информацию о транспортном средстве, поэтому вероятно внесение данных будет происходить вручную, что при большом количестве задействованного автотранспорта будет означать существенные дополнительные затраты трудовых и финансовых ресурсов на выполнение этой работы. Так, по подсчетам экспертов Ассоциации, дополнительные финансовые расходы для одной компании могут достигать 1-1,5 млн. гривень в год. А международным компаниям, которые ведут работу с перевозчиками в специальной стандартизированной глобальной программе (Global Transportation Management Solutions — gTMS), которая не предусматривает внесения подобной информации в ТТН, еще и придется предусмотреть дополнительные временные и финансовые затраты на доработку программы под новые требования.

Ассоциация надеется на решение этого проблемного вопроса во избежание излишнего давления на бизнес. Вместе с этим компании хотели бы обратить внимание на вопрос внедрения реестра ТТН. Для бизнес-сообщества важно знать, на каком этапе находится процесс утверждения Правительством порядок ведения и предоставления информации из реестра ТТН по требованию Закона №1534-IX.

Надеемся внимания к актуальным для бизнеса вопросам!

Ттн образец заполнения 2020 с печатями

Образец заполнения формы транспортной накладной Приложение 4. Транспортная накладная представлена в приложении к Постановлению Правительства от Используется для индексации зарплаты. Используется для расчёта отдельных показателей.

ВИДЕО ПО ТЕМЕ: УСН. Как заполнить ручные ТТН

Дорогие читатели! Наши статьи рассказывают о типовых способах решения юридических вопросов, но каждый случай носит уникальный характер.

Если вы хотите узнать, как решить именно Вашу проблему — обращайтесь в форму онлайн-консультанта справа или звоните по телефонам, представленным на сайте. Это быстро и бесплатно!

Форма 1т правила заполнения

Внести поправки в транспортные документы потребовалось в связи с тем, что чиновники приняли новую редакцию правил перевозок грузов автомобильным транспортом. В новой редакции правила регулируют не перевозки тяжеловесных или крупногабаритных грузов, а перевозки грузов тяжеловесными или крупногабаритными транспортными средствами. Этот документ составляется в трех экземплярах, подписывается отправителем груза, а также перевозчиком.

Некоторые страны требуют дополнительный экземпляр. Если груз везут несколько машин, или в одной машине — несколько разных грузов, количество экземпляров определяется числом машин или видов груза. Если вас интересует, где взять CMR международную товарно-транспортную накладную , у вас есть возможность скачать чистый бланк.

Международная коммерческая перевозка грузов автомобилями регулируется положениями специальной конвенции года. Ее придерживаются многие европейские страны, восточные государства, а также Российская Федерация. Согласно Конвенции, при автоперевозке товаров следует оформлять международную товарно-транспортную накладную CMR, без которой невозможно перевезти какой-либо товар через границу. Транспортная накладная — это пример документа, который заполняется по утвержденной форме, если передающая сторона доставляет принимающей стороне товары на автомобильном транспорте на основании договора перевозки.

В указанном случае накладная должна быть составлена по утвержденной форме. Российские производители продолжают осваивать международный рынок, несмотря на введение санкций. Для ввоза товара на территорию другого государства, помимо таможенной декларации, нужно составить товарно-транспортную CMR-накладную международного образца. Документ составляется при международных грузоперевозках автомобильным транспортом.

Документ-сопровождение оформляется, если страна отправителя или получателя ратифицировала Конвенцию от Нормы Конвенции закрепляют правила и порядок, по которому осуществляются перевозки автомобильным транспортом, в том числе и для государственных муниципальных учреждений п. При наличии в бухгалтерии предприятия бухгалтерской программы, бланк 1-Т в ней есть. Если автоматизированный учет не ведется, скачать форму можно из интернета. Файлы, загруженные в ворде, не очень удобны, т. Лучше использовать форму в формате эксель.

Документ включает 2 раздела: транспортный — для списания и оприходования ценностей сторонами сделки, товарный — для расчетов с транспортной компанией за оказанные услуги. Заказ-наряд подается фрахтователем фрахтовщику, который обязан рассмотреть заказ-наряд и в срок до 3 дней со дня его принятия проинформировать фрахтователя о принятии или об отказе в принятии заказа-наряда с письменным обоснованием причин отказа и возвратить заказ-наряд.

В обязанности грузоперевозчика входит заполнение транспортного второго раздела товарно-транспортной накладной — здесь необходимо указать данные компании-грузоперевозчика точное наименование, юр. Такой же набор сведений должен быть указан и о плательщике они дублируются из лицевой стороны ТТН. Следует также заполнить регистрационные данные автомобиля и ФИО водителя, а также место погрузки и разгрузки и, если есть, сведения о переадресовке.

Образец товарно-транспортной накладной, о котором говорится в этой статье, оформляется во всех случаях перевозки товарно-материальных ценностей автомобильным транспортом. Этот первичный документ подтверждает факт перемещения товаров, что важно для ведения учета как для поставщика, так и покупателя, а также служит основанием для расчетов с грузоперевозчиком. Таким документом стала транспортная накладная далее ТН , являющаяся своего рода подтверждением договорных обязательств при осуществлении транспортировки грузов.

В каких случаях составляется транспортная накладная, кем, и каковы правила ее заполнения, рассказывается в данной статье. Являясь, по сути, собственником, именно покупатель в первом случае берет на себя обязанности по оформлению ТН. Поставщик вписывает номер документа и дату перевозки, реквизиты сторон и сведения о товаре во всех экземплярах. Заверяет все необходимыми подписями и печатями, после чего один из них оставляет у себя, а три других передает перевозчику.

Тот привозит все три экземпляра получателю вместе с грузом, после разгрузки и учета поставленного товара руководитель организации-получателя и материально ответственное лицо ставят свои подписи в получении и заверяют печатью организации, после чего один из оставшихся трех экземпляров оставляют себе, остальные два возвращаются перевозчику.

Транспортная компания на основании полностью заполненных ТТН составляет акт выполненных работ, прикладывает его к одному из своих двух экземпляров вместе со счетом на оплату и пересылает той из сторон сделки, которая будет оплачивать перевозку. К оставшемуся у перевозчика последнему экземпляру прикладывается путевой лист и на основании этих документов производится расчет зарплаты водителя.

Хранятся они в отчетности транспортной компании. Можно грузополучателю на основании транспортной накладной принимать товар материалы к бухгалтерскому учету? Ответ: Нет. Транспортная накладная не имеет стоимостного выражения, служит подтверждением доставки груза. Для оприходования на склад товарно-материальных ценностей и бухгалтерского учета требуется накладная по форме ТОРГ В пункте 7 транспортной накладной должен ли поставить печать грузополучатель?

Ответ: Точного ответа на этот вопрос нет. Правилами перевозок грузов печать на бланке ТН не предусмотрена. Значит, печать не является обязательной. Популярный юрист. Поделитесь записью.

Нюансы заполнения новой транспортной накладной

Поле — номер основания платежа. С 28 марта г. Документ выбирается в зависимости от кода, указанного в поле Если в ячейке стоит ТП или ЗД, то в поле надо проставить 0. Поле 16 — получатель.

Товарно-транспортная накладная 1-Т для грузоперевозок оформляется. Если грузоперевозкой занимается непосредственно грузополучатель, то в 1-Т нет необходимости.

Подписью этого представителя в той же строке и штампом предприятия-грузоотправителя удостоверяется правильность всех данных, записанных в товарно-транспортной накладной, а также выдача груза к перевозке. Графы, в которых нет записей, прочеркиваются. Прием грузов к перевозке теряет своей подписью правильность заполнения перечисленных реквизитов. Грузоперевозчик должен оформить на своего водителя доверенность, а грузоотправитель должен заполнить эти данные в соответствующем месте товарного раздела товарно-транспортной накладной. В нижней части первого раздела ТТН слева должны стоять подписи уполномоченных лиц грузоотправителя тех лиц, кто разрешил и произвел отгрузку, и главбуха , справа — подпись водителя это подтверждение факта передачи ответственности за сохранность груза от грузоотправителя перевозчику.

Заполнение Транспортной Накладной Разные Плательщик И Грузополучатель

Внести поправки в транспортные документы потребовалось в связи с тем, что чиновники приняли новую редакцию правил перевозок грузов автомобильным транспортом. В новой редакции правила регулируют не перевозки тяжеловесных или крупногабаритных грузов, а перевозки грузов тяжеловесными или крупногабаритными транспортными средствами. Этот документ составляется в трех экземплярах, подписывается отправителем груза, а также перевозчиком. Некоторые страны требуют дополнительный экземпляр. Если груз везут несколько машин, или в одной машине — несколько разных грузов, количество экземпляров определяется числом машин или видов груза. Если вас интересует, где взять CMR международную товарно-транспортную накладную , у вас есть возможность скачать чистый бланк. Международная коммерческая перевозка грузов автомобилями регулируется положениями специальной конвенции года.

Пломба В Транспортной Накладной

В году в правила заполнения путевых листов внесены изменения — расширен перечень обязательных реквизитов. Теперь на бланке необходима отметка механика об исправности авто. Если компания работает с унифицированным бланком, то его придется скорректировать. О том, как это сделать — в статье.

Ваша версия браузера не поддерживает современные технологии, поэтому некоторые страницы могут отображаться некорректно. Предлагаем Вам скачать самые современные браузеры.

Требование-накладная: форма М ТТН и ТН — в чем разница. Транспортная железнодорожная накладная. Товарно-транспортная накладная: бланк.

Справка о ДТП по форме 154: сроки выдачи, образец заполнения, бланк

Во всех экземплярах товарно-транспортной накладной грузоотправитель проставляет необходимые данные и заверяет товарно-транспортные накладные подписью, печатью или штампом. Бесплатный онлайн сервис для заполнения. Товарнотранспортная накладная — документ универсальный, его бланк разработан и утверждён.

Порядок заполнения раздела 1 формы 4-ФСС 3 квартала года о вознаграждениях физлицам, то есть о базе по взносам, приведен в таблице 2. Как заполнить раздел 2 формы 4-ФСС 3 квартала г. Как заполнить раздел 5 формы 4-ФСС 3 квартала г. Количество рабочих мест, где по состоянию на 1 января г. Если одновременно перевозится несколько грузов в адрес одного или нескольких получателей, то накладная оформляется на каждую партию грузов и каждому грузополучателю в отдельности. Транспортная накладная выписывается в четырех экземплярах: первый остается у грузоотправителя и предназначается для списания ТМЦ; второй, третий и четвертый экземпляры, заверенные подписями и печатями штампами грузоотправителя и подписью водителя, вручаются водителю.

Транспортная накладная образец рк.

Образец ттн казахстан скачать

В конце июля вступили в силу Правила перевозок грузов автомобильным транспорто м утв. Постановлением Правительства РФ от Когда бухгалтеры стали разбираться с новым документом, у них появилась масса вопросов: кто и когда должен заполнять транспортную накладную, что в какой строке писать, чьи подписи ставить, обязательно ли ставить печать и т. Порядок использования и оформления документов, связанных с автомобильными перевозками, находится в ведении нескольких ведомств, в том числе и Минтранса России. Поэтому вместе с нами на вопросы по заполнению транспортной накладной отвечал представитель этого ведомства. Наша организация-покупатель по договору поставки сама забирает товар со склада поставщика. Для этого мы нанимаем перевозчика. Поскольку наш поставщик к договору перевозки отношения не имеет, он отказывается расписываться и ставить печать в транспортной накладной как грузоотправитель.

в разделе 15 с 22 декабря надо приводить стоимость услуг перевозчика и порядок наименование, адрес, банковские реквизиты, номер телефона. Образец заполнения транспортной накладной.

А в самой накладной в пп. Обязательна ли печать грузоотправителя, грузополучателя и перевозчика или достаточно просто подписи лица, ответственного за перевозку? Этого вполне достаточно, ведь в п.

Форма 1-Т проф: правила заполнения в 2019 году

Товарно-транспортная накладная бланк скачать Excel. ТТН бланк скачать Word. Образец заполнения ТТН. Она необходима для учета движения материальных ценностей и для расчетов по их перевозке.

Путевые листы: правила заполнения в 2019 году

Эта часть документа является основанием для списания груза со склада отправителя и одновременно для приходования его получателем. Вторая часть — транспортная. В ней содержатся сведения непосредственно о перевозке, информация о компании-перевозчике и конкретном водителе, марке автомобиля, времени в пути и километраже, товаре и т.

Товарно-транспортная накладная ТТН — это документ, предназначенный для учета движения товарно-материальных ценностей и расчетов за их перевозку.

Согласно статье Алкогольная и спиртосодержащая продукция, оборот которых осуществляется при полном или частичном отсутствии указанных сопроводительных документов, считаются продукцией, находящейся в незаконном обороте. Форма справки, прилагаемой к товарно-транспортной накладной, и форма справки, прилагаемой к грузовой таможенной декларации, и порядок заполнения таких справок устанавливаются соответственно Постановлением Правительства РФ от 31 декабря г. N «О справке к товарно-транспортной накладной на этиловый спирт, алкогольную и спиртосодержащую продукцию» далее Постановление о справке к ТТН и Постановлением Правительства РФ от 31 декабря г.

Компенсации приобретателям жилья г. Выплаты на детей до 3 лет с года 3. Льготы на имущество для многодетных семей в г. Повышение пенсий сверх прожиточного минимума с года 5. Защита социальных выплат от взысканий в году 6. Увеличение социальной поддержки семей с года 7.

Однако на практике полицейские нередко нарушают права участников ДТП, отказывая в своевременном предоставлении справки. Не допустить этого позволит знание некоторых ведомственных приказов и требований к оформлению подобных документов. При наличии обстоятельств, не позволяющих выдать справку немедленно необходимость выезда сотрудника полиции на другое происшествие, эвакуации транспортных средств, оказания помощи пострадавшим и т. Важно: ссылки полицейских на невозможность выдачи справки по причине отсутствия бланков или в силу других обстоятельств, объективно не препятствующих ее предоставлению, являются неправомерными.

бланк, образец в 2022 году

Автомобіль ________________________________ Причіп/напівпричіп _________________________________ Вид перевезень ________________
                          (марка, модель, тип, реєстраційний номер)                                                 (марка, модель, тип, реєстраційний номер)

Автомобільний перевізник ____________________________________ Водій _____________________________
                                          (найменування / П. І.Б.)                                       (П.І.Б., номер посвідчення водія)

Замовник _____________________
                (найменування / П.І.Б.)

Вантажовідправник ________________________________________________________
                              (повне найменування, місцезнаходження / П.І.Б., місце проживання)

Вантажоодержувач ________________________________________________________
                            (повне найменування, місцезнаходження / П.І.Б., місце проживання)

Пункт навантаження ___________________________________________ Пункт розвантаження _________
                                                                            (місцезнаходження)                                                                                                                     (місцезнаходження)
кількість місць _____________________, масою брутто, т _______________________, отримав водій/експедитор ___________________________
                                               (словами)                                                                         (словами)                                                                                       (П. І.Б., посада, підпис)

Усього відпущено на загальну суму ____________________________________, у тому числі ПДВ ________________
                                                                 (словами, з урахуванням ПДВ)

Супровідні документи на вантаж _______________________
__________________________________________________

Проспективное исследование серийного УЗИ при преходящем тахипноэ новорожденных

https://doi.org/10.1016/j.pedneo.2020.09.002Получить права и содержание

Справочная информация

Преходящее тахипноэ новорожденных (ТТН), диагностированное с помощью Типичное клиническое течение и рентгенологические данные являются наиболее частой причиной респираторной недостаточности у недоношенных новорожденных. Ультразвук легких (УЗИ) все чаще используется для определения TTN в соответствии с различными характеристиками заболевания.Однако в нескольких исследованиях сообщалось о применении LUS для мониторинга клинической эволюции TTN. В этом проспективном исследовании с использованием серийных LUS оценивалась и контролировалась тяжесть TTN.

Методы

С ноября 2018 года по октябрь 2019 года в исследование были включены новорожденные ≥34 недели беременности, поступившие в центр новорожденных Мемориальной больницы Чангун. Новорожденные с диагнозом TTN и нуждающиеся в респираторной поддержке составляли группу TTN ( n = 29), тогда как новорожденные без респираторных заболеваний служили контрольной группой ( n = 23).LUS была проведена и оценена в обеих группах в течение 4 часов после поступления и прослежена через 24 и 48 часов.

Результаты

Всего 65 младенцев были обследованы на предмет включения в исследование, 13 из которых были исключены. Большинство участников в обеих группах продемонстрировали пиковый балл LUS в первый день, который затем постепенно снижался. По сравнению с контрольной группой, оценка LUS в группе TTN была выше в день 1 и день 2, и у нее было значительно большее снижение с дня 1 до дня 2. В группе TTN показатели LUS умеренно коррелировали с оценками тяжести респираторных заболеваний. .

Заключение

Мы провели серийное и количественное исследование LUS у недоношенных и доношенных детей с TTN. Оценка LUS относительно хорошо отражает респираторный статус и может помочь контролировать клиническое течение TTN в случае разрешения или ухудшения.

Ключевые слова

младенец

УЗИ легких

преходящее тахипноэ новорожденного

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Тайваньская педиатрическая ассоциация.Опубликовано Elsevier Taiwan LLC.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Frontiers | Влияние мутаций TTN на иммунное микроокружение и эффективность иммунотерапии у пациентов с аденокарциномой легкого

Введение

В настоящее время злокачественные опухоли рака легких имеют самые высокие показатели заболеваемости и смертности, в то время как аденокарцинома легкого (LUAD) является основным подклассом первичного легкого. рак (около 85%) (1). LUAD имеет длительный инкубационный период, легкие ранние симптомы и высокую степень злокачественности. Обычно пациенты с LUAD прогрессируют до поздней стадии на момент постановки диагноза и упускают шанс на лечение (2). С разработкой различных таргетных лекарств и их применением в LUAD, 5-летняя выживаемость пациентов с LUAD была несколько улучшена, особенно при применении иммунотерапевтических препаратов, таких как белок 1 запрограммированной гибели клеток / лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток (PD- 1 / PD-L1). Однако возникают новые проблемы, и ответ некоторых пациентов на иммунотерапию невысок (3, 4).Поэтому совершенно необходимо выявить новые биомаркеры для прогнозирования лечебного эффекта иммунотерапии.

Все больше исследований начали искать прогностические маркеры ICI в попытке максимизировать клинические преимущества иммунотерапии для пациентов. Исследование показывает, что такие характеристики, как экспрессия PD-L1, TMB, микросателлитная нестабильность (MSI), восстановление повреждений ДНК (DDR), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) могут быть предикторами реакции пациентов на иммунотерапию. Однако широкое распространение этих маркеров имеет множество ограничений.Например, методам обнаружения PD-L1 недостает стандартизации и согласованности, TMB неоднороден для разных лабораторий и платформ, только небольшое количество пациентов с раком легких имеют фенотип MSI-H (<1%) (5–9) и результаты основаны на оценке секвенирования следующего поколения (NGS) различных панелей. Эти факторы предполагают, что поиск новых маркеров для прогнозирования эффективности иммунотерапии является актуальной проблемой, которую необходимо решить в прецизионной иммунотерапии.

TTN используется для экспрессии миозина, который связан неструктурированными пептидными последовательностями и отвечает за поддержание мышечного напряжения (10), в то время как актин является третьим по содержанию белком в мышцах.Поскольку ген TTN содержит длинную последовательность, любая мутация в гене TTN может привести к дисфункции миозина, что приведет к аномальному росту мышечных волокон (10). Многие предыдущие исследования были сосредоточены только на мутации TTN, связанной с дистрофией скелетных мышц и семейной гипертрофической кардиомиопатией (11). Однако в последние годы все больше исследований начали изучать взаимосвязь между мутацией TTN и иммунотерапевтическим ответом солидных опухолей (12, 13). Jia et al. выявили значительную положительную корреляцию между частотой объективного ответа (ЧОО) и частотой мутаций TTN после приема монотерапии анти-PD-1 / PD-L1 / CTLA-4 (P = 0.0015; R = 0,5796). Они также обнаружили, что OS пациентов с TTN-мутантами (TTN-MT) была значительно дольше, чем у пациентов с TTN-диким типом (TTN-WT) в когорте иммунотерапии меланомы (лог-ранг P = 0,0113), и наблюдали заметное снижение при риске побочных реакций (13).

Кроме того, Ян и его коллеги обнаружили, что мутации MUC4, MUC16 и TTN были связаны с иммунным прогнозом рака желудка в когорте иммунотерапевтов (12). С развитием клинических испытаний иммунотерапии LUAD взаимосвязь между TTN-MT и прогнозом иммунотерапии и ответом на LUAD остается неясной.Чтобы изучить взаимосвязь между TTN-MT и клиническим прогнозом пациентов с LUAD после получения ICI, мы собрали и проанализировали когорту LUAD после монотерапии анти-PD-1 / PD-L1 / CTLA-4, когорту TCGA-LUAD и другие опубликовал когорту LUAD. В этой статье делается попытка изучить взаимосвязь между мутациями TTN и иммунотерапией в рамках TIME.

Методы

Коллекция когорты LUAD

Мы загрузили когорту LUAD (ICIs-когорта) с планами лечения на основе ICIs из дополнительных материалов опубликованного исследования (12).План лечения когорты и метод определения последовательности подробно описаны в этом исследовании. В последующем анализе мы использовали данные о мутациях (WES) и клинические данные этой когорты. Кроме того, мы получили данные о РНК-seq и мутациях из базы данных Genomic Data Commons (GDC; https://portal.gdc.cancer.Gov/) когорты TCGA-LUAD. Используя cbioportal (http://www.cbioportal.org/), мы загрузили другую когорту LUAD (Chen-LUAD), которая включает данные экспрессии и данные мутаций (WES) (14). Патологические диагнозы подробно описаны в дополнительных методах.

Анализ ВРЕМЕНИ и иммуногенности

Относительную долю 22 иммунных клеток оценивали с использованием алгоритма CIBERSORT (15), который можно реализовать на http://cibersort. stanford.edu/. Алгоритм CIBERSORT анализирует данные экспрессии в когорте TCGA-LUAD в соответствии с сигнатурой LM22 (22 иммунных клетки) и 1000 перестановок. Кроме того, они играют соответствующие роли в иммунном ответе (например, процессинг и презентация антигена, воспалительный ответ, хемокины и иммунное истощение), полученные из дополнительных материалов опубликованных исследований (16, 17).Показатели TMB, NAL и иммунитета были получены из опубликованного исследования (17), а набор генов пути DDR был получен из базы данных MsigDB (18).

Анализ пути

На основе GSEA мы использовали пакет R «limma» для анализа разницы между данными РНК-seq TCGA-LUAD и Chen-LUAD. TCGA-LUAD, Chen-LUAD, logFC и ENTREZID использовались в качестве входных файлов GSEA при анализе различий (19). Пакет R «ClusterProfiler» использовался для анализа наборов путей входных данных (ранг logFC и ENTREZID) в базах данных GO-BP, GO-CC, GO-MF, KEGG и REACTOME (20).Для ssGSEA мы использовали пакет R «GSVA» (21) для анализа данных RNA-seq TCGA-LUAD и Chen-LUAD, а набор используемых путей включает c2. cp.kegg.v7.1.Symbols.gmt , c2.cp.reactiome.v7.1.symbols.gmt и c5.all.v7.1.symbols.gmt, которые были получены из базы данных MsigDB (18).

Статистический анализ

Тест Манна-Уитни-U использовался для сравнения различий в непрерывных переменных между двумя группами: TMB, NAL; коэффициент инфильтрации иммунных клеток; и экспрессия связанных с иммунитетом генов.Кроме того, мы использовали точный тест Фишера для сравнения различий в переменных классификации между двумя группами, таких как частота генных мутаций. Метод Каплана-Мейера (KM) (22) использовался для сравнения разницы во времени выживания между двумя группами, в то время как значение P логарифмического ранга представляет статистическую разницу между анализами KM. Анализ GSEA использовал P-значение и показатель обогащения для оценки статистических различий в результатах GSEA. Затем мы использовали пакет R «limma» для сравнения различий в родственных патологических путях между двумя группами.

Результаты

TTN-MT связано с прогнозом пациентов с LUAD, получающих иммунотерапию

Чтобы изучить прогностическую роль TTN-MT в прогнозе пациентов с LUAD после терапии ICI, мы использовали одномерную модель регрессии COX и многомерную модель регрессии COX для последующие анализы. Две карты леса показывают результаты одномерного анализа СОХ и многомерного анализа СОХ соответственно. Рисунок 1A показывает, что только мутации TTN могут использоваться для прогнозирования прогноза пациентов с LUAD в однофакторной регрессионной модели COX (P = 0.014; HR: 0,37). Мы обнаружили, что другие клинические характеристики (такие как пол, возраст, годы в упаковке) и TMB, известный фактор, связанный с прогнозом иммунотерапии, не были связаны с прогнозом пациентов с LUAD. Рисунок 1B показывает, что только статус мутации TTN может использоваться в качестве независимого предиктора иммунотерапии для пациентов с LUAD в многомерной регрессионной модели COX (P = 0,0108; HR: 0,24). Затем мы использовали KM-анализ, чтобы дополнительно выявить роль мутации TTN во времени OS у пациентов с LUAD.По сравнению с TTN-WT LUAD, пациенты с TTN-MT LUAD имели значительно улучшенное время OS [лог-ранг P = 0,009, HR = 0,43; 95% Cl: 0,2–0,93 (рис. 1C)]. Кроме того, LUAD имеет более высокую долю клинических преимуществ иммунотерапии, чем улучшенное время OS, TTN-MT (рисунки 1D, E). Кроме того, мы обнаружили, что у пациентов с TTN-MT LUAD значительно увеличилось количество лет на упаковку по сравнению с TTN-WT LUAD (рисунок 1F).

Рис. 1 TTN-MT ассоциировался с пролонгированным OS у пациентов с LUAD, ответивших на лечение ICI.Однофакторный регрессионный анализ Кокса (A) и многомерный регрессионный анализ Кокса в подгруппах по статусу TTN, возрасту, полу, статусу TMB и количеству лет в когорте ICI (B) . (C) Кривые Каплана-Мейера, сравнивающие общую выживаемость (OS) пациентов с TTN-MT и пациентов с TTN-WT в когорте ICI. (D) TTN-MT было связано с клинической пользой (ответ Roh). (E) TTN-MT было связано с клинической пользой (Ван Аллен). (F) TTN-MT ассоциировалось с более длинными годами упаковки.* P <0,05.

Обзор мутировавших генов-драйверов в статусе мутации TTN

Для изучения профилей мутировавших генов-драйверов в различных статусах мутации TTN мы проанализировали 20 генов-драйверов с самой высокой частотой мутаций у пациентов с LUAD в когорте ICI и когортах TCGA. , соответственно. Большинство типов мутаций генов-драйверов в когорте ICI в основном представляют собой миссенс-мутации [такие как TP53, MUC16, KRAS, LRP1B, CTNNA2, KEAP1, NF1, CDh20, AKAP9, FAT4, PTPRB, PTPRD, SETBP1, STK11, ATM и CTNND2 (Рисунок 2A)].Кроме того, большинство из 20 ведущих генов-драйверов когорты ICI с высокой частотой мутаций относятся к онкогену, а немногие — к TSG. Кроме того, частота мутаций AKAP9 (27,3 против 4%) и CUX1 (22,7 против 0%) в группе TTN-MT была значительно выше, чем в группе TTN-WT (P <0,05).

Напротив, частота мутации STK11 (0 против 24%) в группе TTN-MT была значительно ниже, чем в группе TTN-WT (P <0.05). В когорте TCGA большинство генов-драйверов принадлежат онкогену, в то время как очень немногие гены-драйверы принадлежат TSG. Мы обнаружили, что частота мутаций большинства генов-драйверов в группе TTN-MT была значительно выше, чем в группе TTN-WT. Эти частоты включают TP53 (61,9 против 36,4%), TTN (100 против 0%), MUC 16 (56,8 против 25,2%), CSMD 3 (52,9 против 23%), LRP1B (47,1 против 20%), УШ3А (45,1 против 18%), ZFHX4 (44,4 против 17,7%), FLG (35 против 16,4%), XIRP2 (38,1 против 13,8%), SPTA1 (33,9 против 16,4%), NAV3 (30 против 11,8%), FAT3 (29,6 против 11,8%), COL11A1 (28,8 против 12,1%), ZNF536 (29,6 против 11,1%), ANK2 (28,8 против 11,1%), CSMD1 (27,2 против 12,1%), PCLO (30 против 9,5%) и PCDh25 [29,2 против 9,8% (Рисунки 2B)]. Кроме того, мы проанализировали и визуализировали взаимное исключение и статус совместной встречаемости 20 основных мутировавших генов-драйверов в когорте ICI и когорте TCGA, соответственно (рисунки 2C, D).

Рисунок 2 Геномные профили пациентов с LUAD. 20 лучших мутировавших генов-драйверов в когорте ICI (A) и когорте TCGA-LUAD (B) . Ленточный график, показывающий совместную встречаемость (или взаимоисключающую связь) между парами мутировавших генов-драйверов в когорте ICI (C) и когорте TCGA-LUAD (D) . * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001.

ВРЕМЯ при мутации TTN

ВРЕМЯ является неотъемлемой частью постиммунотерапевтического ответа онкологических больных.Следовательно, мы сравнили ВРЕМЯ при различных статусах мутации TTN с точки зрения компонентов ВРЕМЕНИ, таких как инфильтрирующие иммунные клетки, исследуемые молекулы и оценки. Во-первых, CIBERSORT был использован для оценки относительной численности 22 инфильтрации иммунных клеток у пациентов с LUAD. Сравнивая различия в соотношении иммунных клеток при различных статусах мутации TTN (рис. 3A), мы обнаружили, что макрофаги M0-типа, макрофаги M1-типа, активированные Т-клетки памяти CD4 и CD8 + Т-клетки были значительно обогащены ВРЕМЯ TTN- Группа МТ.Напротив, ВРЕМЯ группы TTN-WT было обогащено некоторыми иммунными клетками со статической функцией, такой как покоящиеся DC, покоящиеся тучные клетки и покоящиеся Т-клетки памяти CD4. Результаты иммунных контрольных точек не показали значительной разницы в уровне экспрессии большинства иммунных контрольных точек между группами TTN-WT и TTN-MT. Экспрессия LAG3 в группе TTN-MT была значительно выше, чем в группе TTN-WT (рис. 3B). На рисунке 3C показаны типичные случаи для каждого уровня TPS (TTN: два MT vs. два корпуса WT). Кроме того, мы также сравнили некоторые показатели иммунитета, связанные с иммунным ответом, и результаты показали, что группа TTN-MT была частично изменена. Баллы дефектов гомологичной рекомбинации и клеток Th3 были значительно выше, чем у группы TTN-WT (рис. 3D).

Рисунок 3 Связь статуса TTN и иммунной инфильтрации у пациентов с LUAD. (A) Сравнение 22 иммунных клеток между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте TCGA-LUAD. (B) Сравнение молекул иммунных контрольных точек между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте TCGA-LUAD. (C) Типичные случаи для каждого уровня TPS между группами TTN-MT (два образца; высокий PD-L1 TPS) и TTN-WT (o образцов; без PD-L1 TPS) в Local-LUAD. Используя слайды, окрашенные HE- и PD-L1, мы вручную оценили количество опухолевых клеток, размер образца (диаметр), степень дробления с пороговым значением <1% (без PD-L1 TPS), 1–50%. (низкий TPS PD-L1), 50% <(высокий TPS PD-L1) и TPS для каждого образца биопсии с использованием предметного стекла, содержащего наибольшее количество опухолевых клеток.Уровень TPS оценивали патологоанатомы, прошедшие тренинг по оценке TPS. (D) Сравнение показателей иммунитета между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте TCGA-LUAD. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001, нс, не значимо.

Группа ТТН-МТ имеет более высокую иммуногенность

Высокая иммуногенность полезна для организма при выявлении и уничтожении опухолей и получении клинических преимуществ от иммунотерапии. Поэтому для определения иммуногенности мы сравнили различия в различных статусах мутаций TTN.Для TMB группа TTN-MT имела значительно более высокий уровень TMB, чем группа TTN-WT как в когорте ICI, так и в когорте TCGA-LUAD (рисунки 4A, B; все P <0,05). Затем мы сравнили NAL в когорте TCGA, и рисунок 4C показывает, что уровень NAL в группе TTN-MT был значительно выше, чем в группе TTN-WT (рисунок 4C; P <0,0001). Система восстановления повреждений ДНК играет жизненно важную роль в правильном восстановлении повреждений ДНК и предотвращении чрезмерного накопления неправильной ДНК. Мы использовали восемь связанных с DDR путей, собранных из базы данных MsigDB, и объединили их в один общий сигнал DDR.Кроме того, мы обнаружили, что количество генных мутаций в путях, связанных с DDR, в группе TTN-MT было значительно выше, чем в группе TTN-WT (рис. 4D; все P <0,05).

Рисунок 4 Связь статуса TTN и иммуногенности у пациентов с LUAD. Сравнение TMB между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте ICI (A) и когорте TCGA-LUAD (B) . (C) Сравнение NAL между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте TCGA-LUAD. (D) Сравнение количества мутаций сигнальных путей DDR между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте TCGA-LUAD. * P <0,05; **** P <0,0001.

Степень активации иммунных и патологических путей в статусе мутации TTN

Степень активации иммунных и патологических путей пациентов с LUAD связана с их прогнозом на получение иммунотерапии. Поэтому мы использовали GSEA и ssGSEA для оценки активности проводящих путей у пациентов с LUAD. Мы обнаружили, что активность иммунных путей в группе TTN-MT была значительно выше, чем в группе TTN-WT (Рисунки 5A, B).Эта активность включает в себя несколько процессов: процесс биосинтеза хемокинов, секретар хемокинов, выработка фактора некроза опухоли, позитивная регуляция продукции цитокинов в суперсемействе факторов некроза опухоли, белковый комплекс MHC класса II, активность рецептора цитокинов, дифференцировка клеток Th27, Toll- Как рецептор TLR1: каскад TLR2 и каскад Toll-Like рецептора 2 (TLR2). Напротив, в пути, связанном с DDR (Фигуры 5A, B), активность группы TTN-MT была значительно ниже, чем группа TTN-WT в репарации ДНК, репарации двухцепочечных разрывов, репарации двухцепочечных разрывов через гомологию рекомбинация и репарация двухцепочечных разрывов ДНК.

Рисунок 5 Связь статуса TTN и активности сигнальных путей у пациентов с LUAD. Результаты GSEA в когорте TCGA-LUAD (A) и когорте Chen-LUAD (B) . Цвет кривой соответствует цвету шрифта пути. GSEA наборов отличительных генов был загружен из MSigDB, и каждый прогон выполнялся с 1000 перестановками. Показаны результаты обогащения со значительными различиями между опухолями TTN-MT и TTN-WT. Тепловая карта, отображающая средние различия в оценке ssGSEA между TTN-MT и TTN-WT в TCGA-LUAD (C) и когорте Chen-LUAD (D) .Ось Y показывает оценку путей ssGSEA. Каждый квадрат представляет собой кратное изменение или разность каждой указанной оценки путей ssGSEA путей между TTN-MT и TTN-WT опухолями в LUAD. Красный цвет указывает на усиление регуляции, а синий — на понижающее регулирование. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001.

Кроме того, мы использовали алгоритм ssGSEA для оценки активности пути каждого пациента с LUAD. Активность патологического пути связана с канцерогенезом, и истощение иммунитета в группе TTN-MT было значительно ниже, чем в группе TTN-WT, как в когортах TCGA (Рисунок 5C), так и Chen-LUAD (Рисунок 5D).Эта активность включает каноническую передачу сигналов Wnt, передачу сигналов PI3K, передачу сигналов ERK / MAPK, васкулогенез и TGF бета.

Обсуждение

Иммунотерапия опухолей иммунной системы в основном убивает опухолевые клетки, активируя противоопухолевую иммунную функцию организма, которая характеризуется длительными лечебными эффектами и небольшим количеством побочных реакций (23). В этом исследовании мы доказали, что статус несинонимичных мутаций TTN связан с высоким уровнем иммуногенности, которая в основном проявляется в высоком уровне TMB, высоком NAL и более высоком уровне мутации пути DDR. Кроме того, мы обнаружили, что пациенты с LUAD с мутацией TTN имеют воспалительное ВРЕМЯ, характеризующееся более активированной инфильтрацией иммунных клеток и более высокими показателями иммунитета. Наиболее важно то, что мутационный статус TTN может использоваться в качестве независимого предиктора иммунотерапии для пациентов с LUAD. Это открытие поможет клиницистам отбирать пациентов, которые с большей вероятностью получат пользу от ИКИ в будущей клинической практике.

Вызванная нестабильностью генома, высокая иммуногенность особенно важна для прогнозирования прогноза пациентов, получающих иммунотерапию (24, 25).Как один из наиболее широко изучаемых маркеров, многие исследования показали, что высокий уровень TMB тесно связан с улучшением прогноза пациентов, получающих иммунотерапию (25–27). Увеличенный TMB может способствовать производству нового NAL. ДК могут лечить и представлять этот новый антиген, дополнительно опосредуя трансформацию Т-клеток в зрелые и активированные цитотоксические Т-клетки и, наконец, опосредуя противоопухолевую активность иммунной системы и усиливая реакцию пациентов на лечение ИКИ (13, 28). Следовательно, NAL, еще один важный биомаркер, значительно коррелирует с эффективностью иммунотерапии (29, 30). Недавние исследования показали, что путь, связанный с DDR, является еще одним фактором, который играет важную роль в стабильности генома, поскольку он снижает количество ложных мутаций за счет исправления неправильных повреждений ДНК (31).

Teo et al. доказали, что мутационный статус пути DDR связан с улучшенным прогнозом пациентов с раком мочевого пузыря, получающих иммунотерапию (32). Мы обнаружили, что пациенты TTN-MT LUAD имели более высокое количество мутаций в пути DDR, а активность пути, связанного с DDR, в их TIME показала значительную тенденцию к снижению.В этом исследовании мы обнаружили, что пациенты с LUAD с TTN-MT показали более высокую иммуногенность, такую ​​как высокий TMB, высокий NAL и большее количество несинонимичных мутаций в путях, связанных с DDR. Этот фактор может объяснить улучшение общей выживаемости пациентов TTN-MT LUAD и соотношение клинической пользы от иммунотерапии.

Исследования показали, что помимо иммуногенности, TIME также может повышать реакцию пациентов на иммунотерапию (33–35). Сообщения предполагают, что CD4 + и CD8 + TIL, высокообогащенные опухолью, связаны с более высокой скоростью ответа после получения иммунотерапии (36, 37).Макрофаги, ассоциированные с опухолью внутри опухоли (ТАМ), могут быть перепрограммированы под действием ВРЕМЕНИ и могут переключаться между типом M1 для противоопухолевого иммунитета и типом M2 для стимулирования пролиферации опухоли. Проникновение в опухоль высокого уровня ТАМ M1 связано с хорошим прогнозом (38). Кроме того, во ВРЕМЯ TTN-MT анализ хемокинов показал более высокую активность, секрецию TNF. Исследования показали, что высокие уровни TNF могут способствовать секреции большого количества IFN-γ эффекторными Т-клетками. Этот цитокин дополнительно усиливает экспрессию молекул MHC, активируя сигнальный путь STAT1.Наконец, он может побудить иммунную систему распознавать NAL (39). Кроме того, хемокины CXCL9 и CXCL10 могут рекрутировать активированные Т-клетки и NK-клетки и, наконец, запускать их проникновение в опухоли и дополнительно проявлять противоопухолевую активность (40, 41).

Напротив, активность некоторых патологических путей, ведущих к истощению иммунитета, значительно подавляется в TTN-MT, таких как ERK / MAPK, PI3K / Akt, WNT, трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), FGFR и липид. метаболизм. Williams et al. доказали, что ингибитор PI3K может уменьшить ВРЕМЯ иммунного истощения и повысить чувствительность рака груди к лечению, блокирующему иммунные контрольные точки (42).Wang et al. обнаружили, что TIME опухоль может обратить вспять иммуносупрессию путем блокирования аномально активированной передачи сигналов PI3K / mTOR (43).

Кроме того, сигнальный путь WNT / β играет важную роль в формировании иммунной гетерогенности, такой как ингибирование активации и инфильтрации Т-клеток, стимулирование апоптоза Т-клеток, ингибирование лечения антигеном и его степени, а также подавление убивающего эффекта иммунной системы на опухоль. ячейки (44). TGFβ ингибирует инфильтрацию опухоли CXCR3 и CD8 + Т-клетками (45).Ингибирование TGFβ способствует привлечению и инфильтрации Т-клеток в опухолевый центр и, кроме того, играет роль в противоопухолевой активности (46). Цитокины, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF) и TGFβ, могут приводить к аномальным кровеносным сосудам опухоли и уменьшать инфильтрацию иммунных клеток в опухолевых тканях (47, 48). Холестерин может дополнительно ингибировать противоопухолевую активность Т-клеток, связываясь с трансмембранной областью TCRβ и вмешиваясь в сигнальный путь TCR (49, 50).Эти результаты предполагают, что воспалительный TIME в TTN-MT может привести к улучшению времени OS и лучшим клиническим преимуществам для этих пациентов.

Однако это исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, мы только исследовали взаимосвязь между статусом мутации TTN и прогнозом и ответом на иммунотерапию в одной когорте пациентов с COAD, получавших ICI. Нам все еще нужно проверить эти результаты на нескольких когортах LUAD, получающих ICI. Во-вторых, в этом исследовании отсутствуют эксперименты на клетках и животных для проверки механизмов последующего наблюдения.Мы надеемся, что потенциальный механизм между мутацией TTN и прогнозом пациентов, получающих иммунотерапию, можно будет проверить с помощью клеточных экспериментов и экспериментов на животных в будущем.

Выводы

В этом исследовании мы обнаружили, что TTN-MT может быть прогностическим маркером иммунотерапии для пациентов с LUAD. TTN-MT значительно связан со значительным улучшением прогнозов иммунотерапии у пациентов с LUAD, которые также имеют значительно повышенную иммуногенность и ВРЕМЯ воспалительной опухоли.

Заявление о доступности данных

Исходные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы. Дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

Заявление об этике

Этическая экспертиза и одобрение не требовалось для исследования с участием людей в соответствии с местным законодательством и требованиями организации. Письменное информированное согласие на участие не требовалось для этого исследования в соответствии с национальным законодательством и институциональными требованиями.

Вклад авторов

Концептуализация, SL, XY. Формальный анализ, ZW. Визуализация, ZW. Письмо — черновик, CW. Написание — просмотр и редактирование, SL, XY, ZW, CW. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Рецензент XW заявил о своей общей принадлежности, без сотрудничества с авторами, к руководящему редактору во время рецензирования.

Примечание издателя

Все претензии, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно относятся к их аффилированным организациям или к претензиям издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.

Благодарности

Особая благодарность TopScience Editing за полировку английского языка.Мы ценим технику имформатического анализа Genetron Health (Beijing) Co. Ltd.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc .2021.725292 / full # additional-material

Дополнительная таблица 1 | Точный результат теста Фишера для 20 лучших мутировавших генов-драйверов между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте ICI.

Дополнительная таблица 2 | Точный результат теста Фишера для 20 лучших мутировавших генов-драйверов между опухолями TTN-MT и TTN-WT в когорте TCGA-LUAD.

Дополнительная таблица 3 | Совместная встречаемость (или взаимоисключающая связь) возникает между парами мутировавших генов-драйверов в когорте ICI.

Дополнительная таблица 4 | Совместная встречаемость (или взаимоисключающая связь) возникает между парами мутировавших генов-драйверов в когорте TCGA-LUAD.

Ссылки

1. Niu Y, Lin A, Luo P, Zhu W., Wei T, Tang R, et al. Прогноз пациентов с аденокарциномой легких с мутациями NTRK3 в ингибиторы иммунных контрольных точек. Front Pharmacol (2020) 11: 1213. doi: 10.3389 / fphar.2020.01213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Гарон Э. Б., Ризви Н. А., Хуэй Р., Лейл Н., Балманукян А. С., Эдер Дж. П. и др. Пембролизумаб для лечения немелкоклеточного рака легкого. N Engl J Med (2015) 372: 2018–28. doi: 10.1056 / NEJMoa1501824

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Мелендес Б., Ван Кампенхаут С., Рорив С., Реммелинк М., Лосось I, Д’Аэн Н.Методы измерения мутационной нагрузки опухоли в опухолевой ткани. Transl Lung Cancer Res (2018) 7: 661–7. doi: 10.21037 / tlcr.2018.08.02

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Эндрис В., Буххальтер И., Альгойер М., Ремпель Э., Лиер А., Фолькмар А.-Л. и др. Измерение мутационной нагрузки опухоли (TMB) в рутинной молекулярной диагностике: In Silico и анализ в реальной жизни трех больших панелей генов. Int J Cancer (2019) 144: 2303–12.doi: 10.1002 / ijc.32002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Zhang J, Zhou N, Lin A, Luo P, Chen X, Deng H и др. Мутация ZFHX3 как защитный биомаркер блокады иммунных контрольных точек при немелкоклеточном раке легкого. Cancer Immunol Immunother (2021) 70: 137–51. doi: 10.1007 / s00262-020-02668-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Warth A, Körner S, Penzel R, Muley T., Dienemann H, Schirmacher P, et al.Нестабильность микросателлитов при аденокарциномах легких: всестороннее исследование 480 случаев. Арка Вирхова (2016) 468: 313–9. doi: 10.1007 / s00428-015-1892-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Savarese M, Maggi L, Vihola A, Jonson PH, Tasca G, Ruggiero L, et al. Интерпретация генетических вариантов титина у пациентов с мышечными заболеваниями. JAMA Neurol (2018) 75: 557–65. doi: 10.1001 / jamaneurol. 2017.4899

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11.Цао X, Лю Б., Цао В., Чжан В., Чжан Ф., Чжао Х. и др. Ингибирование аутофагии усиливает апоптоз, индуцированный апигенином, в раковых клетках молочной железы человека. Chin J Cancer Res (2013) 25: 212–22. DOI: 10.3978 / j.issn.1000-9604.2013.04.01

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Miao D, Margolis CA, Vokes NI, Liu D, Taylor-Weiner A, Wankowicz SM, et al. Геномные корреляты ответа на блокаду иммунных контрольных точек в солидных опухолях, устойчивых к микросателлитам. Нат Генет (2018) 50: 1271–81.doi: 10.1038 / s41588-018-0200-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Цзя Q, Ван Дж, Хэ Н, Хэ Дж, Чжу Б. Мутация Титина, связанная с реакцией на блокаду контрольных точек в солидных опухолях. JCI Insight (2019) 4 (10): e127901. doi: 10.1172 / jci.insight.127901

CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Чен Дж., Ян Х., Тео АСМ, Амер Л.Б., Шербаф Ф.Г., Тан CQ и др. Геномный ландшафт аденокарциномы легких у жителей Восточной Азии. Нат Генет (2020) 52: 177–86. doi: 10.1038 / s41588-019-0569-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Ньюман А.М., Лю К.Л., Грин М.Р., Джентлс А.Дж., Фенг В., Сюй Y и др. Надежный подсчет клеточных подмножеств по профилям тканевой экспрессии. Nat Methods (2015) 12: 453–7. doi: 10.1038 / nmeth.3337

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Руни М.С., Шукла С.А., Ву К.Дж., Гетц Г., Хакохен Н. Молекулярные и генетические свойства опухолей, связанные с местной иммунной цитолитической активностью. Cell (2015) 160: 48–61. doi: 10.1016 / j.cell.2014.12.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Либерзон А., Субраманиан А., Пинчбэк Р., Торвальдсдоттир Х., Тамайо П., Месиров Дж. База данных молекулярных сигнатур (MSigDB) 3.0. Биоинформатика (2011) 27: 1739–40. doi: 10.1093 / биоинформатика / btr260

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Смит Г.К. Лимма: линейные модели для данных микрочипов. В: . Решения для биоинформатики и вычислительной биологии с использованием R и Bioconductor . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer (2005). п. 397–420.

Google Scholar

21. Хенцельманн С., Кастело Р., Гинни Дж. GSVA: Анализ вариации генов для данных микрочипов и РНК-Seq. BMC Bioinf (2013) 14: 7. doi: 10.1186 / 1471-2105-14-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Суреш К., Найду Дж., Лин С.Т., Данофф С. Иммунотерапия немелкоклеточного рака легкого через контрольную точку иммунитета: преимущества и легочная токсичность. Сундук (2018) 154: 1416–23. doi: 10.1016 / j.chest.2018.08.1048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Риаз Н., Гавел Дж. Дж., Кендалл С. М., Макаров В., Уолш Л. А., Десрихард А. и др. Рецидивирующие мутации SERPINB3 и SERPINB4 у пациентов, которые реагируют на иммунотерапию против CTLA4. Нат Генет (2016) 48: 1327–9. DOI: 10.1038 / ng.3677

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Хеллманн М.Д., Натансон Т., Ризви Х., Крилан BC, Санчес-Вега Ф., Ахуджа А. и др.Геномные особенности ответа на комбинированную иммунотерапию у пациентов с далеко зашедшим немелкоклеточным раком легкого. Cancer Cell (2018) 33: 843–852.e4. doi: 10.1016 / j.ccell.2018.03.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Ризви Х., Санчес-Вега Ф., Ла К., Шатила В., Йонссон П., Халпенни Д. и др. Молекулярные детерминанты ответа на блокаду анти-запрограммированной гибели клеток (PD) -1 и анти-запрограммированной смерти-лиганда 1 (PD-L1) у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, профилированные с помощью целевого секвенирования следующего поколения. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol (2018) 36: 633–41. doi: 10.1200 / JCO.2017.75.3384

CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Samstein RM, Lee C-H, Shoushtari AN, Hellmann MD, Shen R, Janjigian YY, et al. Мутационная нагрузка опухоли предсказывает выживаемость после иммунотерапии при множественных типах рака. Нат Генет (2019) 51: 202–6. doi: 10.1038 / s41588-018-0312-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Линь В., Линь А., Ли З., Чжоу С., Чен С., Чен Б. и др.Возможное прогностическое значение статуса мутации SCN4A для ингибиторов иммунных контрольных точек при меланоме. BioMed Pharmacother (2020) 131: 110633. doi: 10.1016 / j.biopha.2020.110633

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Снайдер А., Макаров В., Мергоуб Т., Юань Дж., Зарецкий Ю.М., Деричард А. и др. Генетическая основа клинического ответа на блокаду CTLA-4 при меланоме. N Engl J Med (2014) 371: 2189–99. doi: 10.1056 / NEJMoa1406498

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30.Ван С., Хэ З, Ван Х, Ли Х, Лю X-S. Презентация антигена и иммуногенность опухоли в прогнозировании ответа на иммунотерапию рака. Элиф eLife (2019) 8: e49020. doi: 10.7554 / eLife.49020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Луо П., Лин А., Ли К., Вей Т., Чжан Дж. Изменение пути DDR, бремя мутаций опухоли и чувствительность к цисплатину при мелкоклеточном раке легкого: разница, обнаруженная с помощью всего экзома и целевого секвенирования генов. J Thorac Oncol Off Publ Int Assoc Study Lung Cancer (2019) 14: e276–9.doi: 10.1016 / j.jtho.2019.08.2509

CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Teo MY, Seier K, Ostrovnaya I, Regazzi AM, Kania BE, Moran MM, et al. Изменения в ответах на повреждение ДНК и генах восстановления как потенциальный маркер клинической пользы от блокады PD-1 / PD-L1 при запущенных формах уротелиального рака. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol (2018) 36: 1685–94. doi: 10.1200 / JCO.2017.75.7740

CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Si Y, Lin A, Ding W, Meng H, Luo P, Zhang J.Изменение CARD11 в качестве потенциального биомаркера кожной меланомы кожи при лечении блокадой иммунных контрольных точек. Am J Transl Res (2021) 13: 286–300.

PubMed Аннотация | Google Scholar

34. Yi R, Lin A, Cao M, Xu A, Luo P, Zhang J. Мутации ATM приносят пользу пациентам с раком мочевого пузыря, которых лечат с помощью ингибиторов иммунных контрольных точек, воздействуя на микросреду иммунной опухоли. Фронт Genet (2020) 11: 933. doi: 10.3389 / fgene.2020.00933

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35.Линь А., Цю З., Чжан Дж., Ло П. Эффект мутаций NCOR1 на иммунное микроокружение и эффективность ингибиторов иммунных контрольных точек у пациентов с раком мочевого пузыря. Фронт Иммунол (2021) 12: 630773. doi: 10.3389 / fimmu.2021.630773

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Хименес-Рейносо А., Нехме-Альварес Д., Домингес-Алонсо К., Альварес-Валлина Л. Синтетические TIL: спроектированные лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, с улучшенным терапевтическим потенциалом. Передняя панель Oncol (2020) 10: 593848. doi: 10.3389 / fonc.2020.593848

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Урываев А., Пасшак М., Хершковиц Д., Сабо Е., Бар-Села Г. Роль лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), как прогностического биомаркера ответа на терапию анти-PD1 у пациентов с отсутствием метастазов. Мелкоклеточный рак легкого или метастатическая меланома. Мед Онкол (2018) 35:25. doi: 10.1007 / s12032-018-1080-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Сами Э., Пол БТ, Козиол Дж.А., ЭльШами ВМ. Иммуносупрессивное микроокружение в опухолях с избыточной экспрессией TNBC BRCA1-IRIS индуцируется двунаправленным взаимодействием с опухолевыми макрофагами. Cancer Res (2020) 80: 1102–17. doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-19-2374

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Токунага Р., Чжан В., Насим М., Пуччини А., Бергер М.Д., Сони С. и др. CXCL9, CXCL10, CXCL11 / CXCR3 Axis для иммунной активации — цель для новой терапии рака. Лечение рака Ред. (2018) 63: 40–7. doi: 10.1016 / j.ctrv.2017.11.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. House IG, Savas P, Lai J, Chen AXY, Oliver AJ, Teo ZL, et al. CXCL9 и CXCL10, полученные из макрофагов, необходимы для противоопухолевого иммунного ответа после блокады иммунной контрольной точки. Clin Cancer Res an Off J Am Assoc Cancer Res (2020) 26: 487–504. doi: 10.1158 / 1078-0432.CCR-19-1868

CrossRef Полный текст | Google Scholar

42.Уильямс С.Б., Небхан, Калифорния, Ян Дж., Старнес Л.С., Ян С., Вильгельм А.Э. и др. Корреляционные исследования, изучающие эффекты ингибирования PI3K на периферические лейкоциты при метастатическом раке молочной железы: потенциальные последствия для иммунотерапии. Лечение рака груди (2020) 184: 357–64. doi: 10.1007 / s10549-020-05846-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Ван З., Гото Ю., Аллевато М. М., Ву В. Х., Саддави-Конефка Р. , Гиларди М. и др. Нарушение онкогенной сигнальной оси HER3-PI3K-mTOR и блокада PD-1 как мультимодальная прецизионная иммунотерапия при раке головы и шеи. Нац Коммуна (2021) 12: 2383. DOI: 10.1038 / s41467-021-22619-w

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Гундерсон А.Дж., Ямадзаки Т., Маккарти К., Фокс Н., Филлипс М., Алиса А. и др. Tgfβ подавляет экспрессию CD8 (+) T-клетками CXCR3 и передачу опухоли. Нац Коммуна (2020) 11: 1749. doi: 10.1038 / s41467-020-15404-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Мариафазан С., Терли С.Дж., Никлз Д., Кастильони А., Юэнь К., Ван И и др.Tgfβ ослабляет ответ опухоли на блокаду PD-L1, способствуя исключению Т-клеток. Nature (2018) 554: 544–8. DOI: 10.1038 / nature25501

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Хуанг И, Ким БЮС, Чан С.К., Хан С.М., Вайсман ИЛ, Цзян В. Улучшение перекрестных помех между иммунными и сосудистыми линиями для иммунотерапии рака. Nat Rev Immunol (2018) 18: 195–203. DOI: 10.1038 / nri.2017.145

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48.Лю З., Ван И, Хуанг И, Ким БЙС, Шань Х, Ву Д. и др. Сосудистые сети опухолей: новая мишень для иммунотерапии рака. Trends Pharmacol Sci (2019) 40: 613–23. doi: 10.1016 / j.tips.2019.07.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Пэк А.Е., Ю И-РА, Хе С., Уорделл С.Е., Чанг Си-И, Квон С. и др. Метаболит холестерина 27, гидроксихолестерин, способствует метастазированию рака молочной железы за счет своего воздействия на иммунные клетки. Нац Коммуна (2017) 8: 864.doi: 10.1038 / s41467-017-00910-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Свами М., Бек-Гарсия К., Бек-Гарсия Э., Хартл Ф.А., Морат А., Юсефи О.С. и др. Модель фосфорилирования рецепторов Т-клеток на основе холестерина. Иммунитет (2016) 44: 1091–101. doi: 10.1016 / j.immuni.2016. 04.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Длинная некодирующая РНК TTN-AS1 способствует онкогенезу и метастазированию, поддерживая экспрессию TTN в кожной меланоме

Культура клеток и трансфекция

Семь клеточных линий SKCM, включая B16, B16F10, A375, SK-MEL-1, SK- В этом исследовании использовались MEL-5, SK-HEL-1 и Malme-3M.Клетки B16, B16F10 и A375 были приобретены в Shanghai Cell Bank Китайской академии наук (Шанхай, Китай). SK-MEL-1, SK-MEL-5, SK-HEL-1 и Malme-3M были приобретены в ScienCell Research Laboratories (Калифорния, США). Все клетки поддерживали в RPMI1640 (Invitrogen, Шанхай, Китай) с 10% FBS (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и недавно аутентифицировали и тестировали на заражение микоплазмами. Клетки культивировали при 37 ° C в атмосфере, содержащей 5% CO ₂ , и использовали во время фазы их логарифмического роста.Малую шпильочную РНК (shRNA) TTN и lncRNA-TTN-AS1 синтезировали и клонировали в лентивирусный вектор экспрессии piLenti-siRNA-GFP и скремблировали siRNA GFP piLenti-vector, который использовали в качестве отрицательного контроля (Applied Biological Materials Inc. , Ричмонд, Британская Колумбия). Полноразмерные lncRNA-TTN-AS1 были синтезированы и клонированы в лентивирусный вектор экспрессии plenti-GIII-CMV-2A-Puro-GFP (plenti-GIII-CMV-2A-Puro-GFP-lncRNA-TTN-AS1) и пустой лентивирусный вектор в качестве контроля (Applied Biological Materials Inc.). Клетки высевали при 70% конфлюэнтности в 24-луночный планшет и трансфицировали 0,2 мкг вышеупомянутых векторов с использованием реагента для трансфекции Effectene (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Стабильно трансфицированные клетки отбирали с помощью 3 мкг / мл пуромицина (Sangon Biotech, Шанхай, Китай) в течение 4 недель.

Выделение РНК и количественный анализ ПЦР в реальном времени

Общую РНК экстрагировали с использованием TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.кДНК синтезировали из общей РНК с использованием набора PrimeScript ^TM Kit (Takara, Dalian, China). Уровни транскрипции измеряли в двух экземплярах с помощью PowerUp ^TM SYBR ^TM Green Master Mix (Invitrogen). Относительные уровни экспрессии днРНК и мРНК были нормализованы по экспрессии GAPDH. Последовательности праймеров показаны в таблице S1.

Анализ субклеточной локализации

После трансфекции GFP-меченными TTN и lncRNA-TTN-AS1 клетки B16F10 фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре, и DAPI использовали для метки ядра клетки.Локализацию TTN и lncRNA-TTN-AS1 наблюдали с помощью аксиофотомикроскопа AiryScan LSM800 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Анализ ядерного / цитоплазматического фракционирования выполняли с использованием набора PARIS Kit (Ambion, Шанхай, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

Масс-спектрометр / масс-спектрометр с жидкостной хроматографией

Меченая биотином днРНК (как дикого типа, так и мутантного типа) и антисмысловая РНК транскрибировались in vitro с помощью смеси для маркировки биотиновых РНК (Roche, CA, USA) и РНК-полимераза Т7 (Roche), обработанная ДНКазой I, не содержащая РНКаз (Roche) и очищенная с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen).

Праймеры для транскрипции in vitro перечислены в таблице S2. Экстракты клеток B16F10 инкубировали с биотинилированными РНК и 60 мкл гранул стрептавидиновой агарозы (Invitrogen). Связанные белки разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и вырезали определенные полосы. Белки элюировали согласно набору Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit (Invitrogen), расщепляли с помощью подготовки проб с помощью фильтра и затем подвергали системе OrbitrapVelos Pro LC / MS (Thermo Scientific, CA, США).

Проточная цитометрия

Для анализа апоптоза клеток клетки метили аннексином V-APC и йодидом пропидия (PI) в соответствии с инструкциями производителя набора для анализа апоптоза клеток (BD Biosciences, США). Для анализа клеточного цикла клетки окрашивали PI в соответствии с инструкциями производителя набора для анализа клеточного цикла (BD Biosciences, США). Клеточный цикл и апоптоз определяли методом проточной цитометрии (Beckman Coulter, США). Данные анализировали с помощью программы FlowJo v5. 7.3 (Лос-Анджелес, Калифорния, США).

Иммунофлуоресценция

Все клетки фиксировали на предметных стеклах 12 × 12 мм с 4% параформальдегидом в течение 30 мин при комнатной температуре и инкубировали с мышиным антителом против TTN (Millipore, Дармштадт, Германия). После инкубации с вторичным антителом, меченным Cy3 (Servicebio, Ухань, Китай), клетки дважды промывали PBS (HyClone, Юта, США). Для мечения ядра клетки использовали Dapi (Sigma-Aldrich, США). Флуоресценцию анализировали с помощью аксиофотомикроскопа AiryScan LSM800 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

Исследования на животных

Самок мышей C57BL / 6 (5-6 недель, Кавенс, Чанчжоу, Китай) ухаживали в соответствии с положениями и Общими рекомендациями китайского законодательства об управлении экспериментальными животными. Процедуры всех экспериментов на животных соответствовали правилам Институционального комитета по уходу и использованию животных. Все эксперименты на животных были одобрены этическим комитетом Китайского фармацевтического университета. Номер разрешения: SYXK2016–0011. Для анализа ксенотрансплантата опухоли клетки B16F10 стабильно трансфицировали shРНК и скремблирующими плазмидами.Затем мышей случайным образом группировали (пять групп, n = 6) и клетки ксенотрансплантировали (1 × 10 ⁷ /100 мкл) мышам после сбора с планшетов для культивирования клеток. Во время эксперимента исследователь был не осведомлен о распределении групп. Вес мышей и объем опухоли измеряли каждые 6 дней. Двадцать пять дней спустя мышей умерщвляли и опухоли удаляли для дальнейшего анализа. Иммуногистохимия была проведена для описания распределения Ki-67 и TTN.

Для анализа метастазов опухоли мышей случайным образом группировали (пять групп, n = 6) и 1 × 10 ⁶ GFP-меченных клеток B16F10 внутривенно вводили самкам мышей C57BL / 6. Метастазирование опухоли наблюдали с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo с использованием IVIS Lumina series III (PerkinElmer, Waltham, USA) один раз в 10 дней. Мышей умерщвляли через 1 месяц. Для исследования удалены легкие и почки. Окрашивание HE использовали для наблюдения за метастатическими поражениями, а иммуногистохимия была проведена для описания распределения Ki-67 и TTN.

Анализы жизнеспособности клеток, образования колоний, миграции / инвазии через лунки и заживления ран

Анализы жизнеспособности клеток, образования колоний, миграции / инвазии через лунки и заживления ран проводили, как описано ранее ^8,25 . Анализ жизнеспособности клеток проводили с использованием набора CCK8 (Abmole, Хьюстон, США).

Анализ метилирования lncRNA-TTN-AS1

ПЦР, специфичная для метилирования, была использована для анализа метилирования lncRNA-TTN-AS1. Праймеры для бисульфитного секвенирования были разработаны на сайте MethPrimer (http: // www.urogene.org/methprimer/). Геномную ДНК экстрагировали из раковых клеток в соответствии со спецификациями производителя QiAmp DNA blood Mini Kit (Qiagen), а затем модифицировали бисульфитом с использованием набора EZ DNA Methylation-Gold (Zymo, CA, USA). 100 мг элюированной модифицированной бисульфитом ДНК амплифицировали с праймерами, специфичными для метилированных или неметилированных последовательностей ДНК. Последовательности праймеров для MS-PCR показаны в таблице S1.

Анализ активности промотора TTN

Фрагмент ДНК длиной 2000 п.н., расположенный в 5′-выше кодирующей последовательности TTN, амплифицировали с использованием геномной ДНК клетки B16F10 и клонировали в векторе pGL3-Baxic (Hanbio biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай). Клетки 293T трансфицировали фрагментами промотора, которые вставляли в плазмиду pGL3 и pRL-TK (Hanbio biotechnology). Активность люцифераз Firefly (Fluc) и Renilla (Rluc) определяли через 48 часов.

Анализ стабильности РНК

LncRNA-TTN-AS1 был нокдаун или сверхэкспрессирован в клетках B16F10. Через 24 ч прикрепленные клетки инкубировали с 50 мкг / мл α-аманитина (Millipore, США) для блокирования синтеза новой РНК. Клетки собирали через 48 часов и экстрагировали общую РНК. Стабильность РНК измеряли с помощью qRT-PCR в каждый указанный момент времени после блокирования синтеза новой РНК и нормализовали до 18s рРНК.

Вестерн-блоттинг и антитела

Лизаты клеток гомогенизировали в буфере для радиоиммунопреципитации (Roche, CA, USA). Белки разделяли электрофорезом в геле с 12% додецилсульфатом полиакриламида (SDS) и переносили на поливинилиденфторидные мембраны (Millipore, США), которые затем инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C.После инкубации со специфическим HRP-конъюгированным козьим анти-кроличьим IgG сигнал хемилюминесценции детектировали с помощью BeyoECL Plus (Beyotime, Китай). Антитела против циклина D1 (# WL01435a), CDK2 (# WL01543), CDK4 (# WL01711), Bax (# WL01637), прокаспазы 3 (# WL02117), расщепленной каспазы 3 (# WL02117), прокаспазы 9 ( # WL03421) и расщепленная каспаза 9 (# WL03421) были приобретены в Wanleibio (Шэньян, Ляонин, Китай). Антитело против титина / CMD1G (# bs-9861R) было приобретено в Bioss (Пекин, Китай). Антитело против β-актина (№70-ab36861–050) и конъюгированные с HRP козьи антикроличьи IgG (№70-GAR007) были приобретены в Liankebio (Ханчжоу, Чжэцзян, Китай). Экспрессия белка была нормализована до уровня β-актина.

Статистический анализ

Все эксперименты проводились не менее трех раз. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD) на основе трех независимых экспериментов. Все статистические анализы проводились с использованием GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США).Все данные имели нормальное распределение, и различия между группами, которые сравниваются статистически, были одинаковыми. Статистическую оценку выполняли с использованием критерия Стьюдента t (двусторонний) между двумя группами или одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным критерием Тьюки для множественных сравнений. Анализ выживаемости проводился с использованием теста Каплана-Мейера, а логранговый тест использовался для сравнения различий между группами пациентов. Статистика со значением P <0.05 считались статистически разными (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001).

Устойчивость микробных сообществ кишечника человека к длительному пребыванию с несколькими сменами питания

Мы с большим интересом прочитали статью Беннета и др. 1, в котором исследовалось влияние диетических изменений на микробиоту кишечника. Вместе с несколькими недавними исследованиями 2–5 они показали, что краткосрочные изменения в питании могут изменить состав микробиоты кишечника как у пациентов, так и у здоровых людей.Тем не менее, в этих работах был сделан вывод только с несколькими временными точками, и испытуемые подверглись только одной диетической смене. Динамические паттерны микробных сообществ в более длительных временных масштабах с множественными диетическими изменениями остаются неясными.

В этом исследовании мы набрали группу китайских волонтеров (VT), состоящую из 10 человек, которые уехали из Пекина, провели длительное 6-месячное пребывание в Тринидаде и Тобаго (TAT) и вернулись в Пекин. Образцы фекалий (188 образцов) вместе с подробной диетической информацией были собраны с использованием стратегии продольного отбора проб с высокой плотностью (в среднем 19 временных точек для членов VT).Мы разделили все продольное исследование на шесть фаз: T1 представляет собой фазу перед поездкой (20 выборок), T2 (28 выборок), T3 (60 выборок) и T4 (21 выборка) представляют три временных интервала, когда VT оставалась в TAT, и Т5 (35 отсчетов) и Т6 (20 отсчетов) представляют собой два временных интервала после возвращения VT в Пекин. Между тем, мы также собрали образцы у здоровых уроженцев Пекина (BJN, 57 образцов), здоровых аборигенов TAT (TTN, 28 образцов), пациентов TAT (TTP, шесть образцов) и TAT китайцев (TTC, восемь образцов) в качестве контрольных наборов данных.Наконец, мы секвенировали гипервариабельную область V4 микробных генов 16S рРНК для 287 образцов фекалий от 41 человека и проанализировали высококачественные считывания с помощью QIIME.

Интересно, что мы обнаружили, что сообщества кишечных микробов двунаправленно пластичны и устойчивы в течение длительного пребывания с множественными диетическими изменениями. Во-первых, BJN и TTN демонстрируют разные паттерны микробных сообществ (рисунок 1A). Однако микробные сообщества членов VT сместились от сходных с BJN к паттерну TTN, сопровождающему их пребывание в TAT, и вернулись к своим исходным паттернам в течение 1 месяца после возвращения VT в Пекин (рис. 1B – F).Такой пластический рисунок также подтверждается анализом DeBlur7. Кроме того, хотя мы обнаружили, что местоположения и популяции оказывают сильное влияние на дифференциацию выборок (рис. 1G, H), динамические изменения для каждого члена VT показали определенные тенденции (рис. 1I, J), что указывает на возможные пластические паттерны, зависящие от энтеротипов. среди членов VT. Кроме того, относительная численность филума Firmicutes и Bacteroidetes продемонстрировала сильную устойчивость на временной шкале, и они имеют отрицательную корреляцию на временной шкале (рис. 1K, L).Точно так же относительное количество Proteobacteria и Actinobacteria также показало пластические узоры (рис. 1M, N). Прослеживая и сравнивая общие операционные таксономические единицы (OTU), общие для не менее 10% членов VT, мы обнаружили, что отдельные OTU внутри Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria имеют отличительную временную динамику во время длительного пребывания VT (рисунок 10 – R).

Рис. 1

Структура микробного сообщества кишечника человека во время длительного пребывания с несколькими сменами диеты.Динамика микробных сообществ кишечника человека показана путем сравнения различных групп / фаз образцов, включая (A) группы BJN и TTN, (B) группы BJN, TTN и T1, (C) группы BJN, TTN, T1 и T2-T4. , (D) группы BJN, TTN, T1, T2-T4 и T5-T6, (E) группы BJN, TTN, T1, T2-T4, T5-T6 и TTC, (F) BJN, TTN, T1, T2- Группы T4, T5-T6, TTC и TTP. Большие стрелки указывают на постепенное добавление групп для сравнения. Профиль всех проб фекалий, помеченных (G) местами сбора и (H) популяциями (китайцы или ТАТ).В (H) метка «китайский» представляет все образцы из BJN, VT и TTC, а метка «TATs» представляет все образцы из TTN и TTP. Динамические изменения микробиоты кишечника для двух членов VT, включая (I) VT5 и (J) VT6. Кривые со стрелками на (I) и (J) представляют направления изменений микробных сообществ. Панели (K), (L), (M) и (N) показывают динамику средней относительной численности Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria вдоль временной оси.Результаты визуализировали с помощью PCoA взвешенных расстояний UniFrac профилей ампликонов 16S рРНК. OTU, общие для не менее 10% образцов VT во время одной и той же фазы (зеленые столбцы), отслеживаются с использованием графиков Санки для (O) Firmicutes, (P) Bacteroidetes, (Q) Proteobacteria и (R) Actinobacteria. Высота столбцов пропорциональна количеству OTU, а фазы расположены в хронологическом порядке. Линии представляют собой переход OTU между фазами и окрашены в соответствии с первой фазой их появления.На этом рисунке использованы следующие сокращения: BJN, уроженцы Пекина; OTU, операционные таксономические единицы; PCoA, анализ главных координат; TTN, уроженцы Тринидада и Тобаго; Т1-Т6, шесть фаз; TTC, китайский язык из Тринидада и Тобаго; ТТП, пациент из Тринидада и Тобаго; ВТ, отряд волонтеров.

Двунаправленная пластичность человеческого микробного сообщества в значительной степени опосредована диетическими сдвигами. Во время своего пребывания в TAT члены VT потребляли местные продукты (онлайн-дополнительная таблица 1), в основном, включая рыбу и морепродукты, молочные продукты и очищенное зерно, которые значительно отличались от продуктов в Пекине (онлайн-дополнительная таблица 2).Значительная корреляция наблюдалась между диетическими сдвигами и динамикой микробных структур кишечника (p <0,05, тест Мантеля, дополнительные онлайн-таблицы 3 и 4).

Двунаправленная пластичность микробиома кишечника, показанная в этом исследовании, может оказывать влияние на клиническую практику заболеваний, связанных с микробиомом кишечника, по крайней мере, двумя способами: во-первых, это указывает на то, что диагностика должна включать диетические привычки и записи о поездках. Во-вторых, было высказано предположение, что из-за сильной устойчивости кишечных микробных сообществ в клинической практике, такой как трансплантация фекальной микробиоты и лечение антибиотиками, следует отслеживать терапевтические эффекты в более длительном масштабе времени. 8

Благодарности

Мы благодарим Юмин Сун и всех других членов Посольства Китайской Народной Республики в Республике Тринидад и Тобаго за их поддержку в сборе образцов для этой работы. Мы благодарим Ле Цао и Чаофан Чжун из колледжа естественных наук и технологий Университета науки и технологий Хуачжун, Ухань, Китай, за их помощь в подготовке рисунков.

Ранние предикторы преходящего тахипноэ у новорожденных

Предпосылки: Ранняя диагностика преходящего тахипноэ у новорожденных (TTN) важна для раннего лечения и хорошего прогноза, но это неправильно диагностируется при некоторых заболеваниях, которые возникают у новорожденных, например, неонатальном сепсисе.Цель: исследование направлено на изучение лактата, лактатдегидрогеназы (LDH) и цистатина-C (Cys-C) в качестве маркеров для ранней диагностики TTN. Пациенты и методы: образцы крови, взятые в течение 1 часа после рождения у 40 новорожденных, у которых позже развился TTN, и у 40 новорожденных, у которых не развился TTN, в качестве контрольной группы. В это исследование были включены восемьдесят новорожденных, поступивших в отделение интенсивной терапии при университетской больнице Танта с гестационным возрастом более 37 недель в течение периода 12 месяцев (с декабря 2011 г. по май 2012 г.).Новорожденные с РД в течение первых 24 часов жизни составили группу пациентов (n = 40; 28 мужчин: 12 женщин), а новорожденные без респираторных проблем составили контрольную группу (n = 40; 20 мужчин; 20 женщин), письменное информированное согласие было получено. получено от всех родителей. Результаты: дети с TTN показали значительно более высокие уровни лактата, активности лактатдегидрогеназы (LDH) и цистатина-C (Cys-C) (P <0,05) в сыворотке, чем дети без TTN, которые выступают в качестве контрольной группы. значение 2.2 пг / мл для лактата сыворотки в качестве порогового значения чувствительность составляла 92%, специфичность составляла 85%, + PV% составлял 87%, а -PV% составлял 81%, а точность составляла 88. При использовании значения 920 МЕ / л для сывороточного ЛДГ в качестве порогового значения чувствительность составила 94%, специфичность - 87%, + PV% - 89%, -PV% - 82%, точность - 90. При использовании значения 1,73 мг. / L для Cyst-C в качестве порогового значения чувствительность составила 96%, специфичность — 90%, + PV% — 94%, -PV% — 87%, точность — 92%.Заключение: уровень лактата в сыворотке, активность ЛДГ и уровень Cys-C повышены у детей с TTN по сравнению с детьми без TTN. Следовательно, лактат, ЛДГ и Cys-C можно использовать для ранней диагностики TTN и раннего лечения с лучшим прогнозом.

Последние достижения в инженерии биокатализа гема — Schmitz — 2019 — Биотехнология и биоинженерия

1 ВВЕДЕНИЕ

Способность окислять широкий спектр субстратов стерео- и регио-специфическим образом поставила в центр разнообразных исследований, а также промышленного применения ферменты, содержащие гем в качестве простетической группы.Среди них монооксигеназы цитохрома P450 (P450s), пероксидазы гема и пероксигеназы. Эти гемовые ферменты представляют собой универсальные биокатализаторы с присущим им широким спектром реакций, катализируемых естественным путем, все из которых включают первоначальный формальный перенос оксена. Катализируемые реакции варьируются от C – H-активации, такой как гидроксилирование, деалкилирование и окисление ароматического кольца, до окисления гетероатома и разрыва углерод-углеродной связи. В дополнение к широкому спектру реакций некоторые из них, особенно P450, также принимают огромное количество различных субстратов, таких как жирные кислоты и стероиды, а также ксенобиотические соединения, такие как лекарства и токсины.Взяв эти преимущества вместе, ферменты, содержащие гем в качестве простетической группы, являются интересными кандидатами для синтетических и биотехнологических приложений. Важными областями применения являются производство метаболитов лекарств, синтез тонких химикатов, таких как ароматизаторы, ароматизаторы и химические вещества в косметике, производство прекурсоров для синтеза полимеров или биоремедиации. Однако промышленное применение, особенно P450, остается ограниченным из-за низкой активности, низкой устойчивости к органическим растворителям, необходимости регенерации кофакторов и отсутствия стабильности. Это отражается в том факте, что только несколько процессов соответствуют минимальному требуемому пространственно-временному выходу для фармацевтических или химических производственных процессов, например, синтез оригинального лекарственного препарата 4′-гидроксиметил-α-пирролидинобутирофенон или превращение алкенов в α, ω-дикарбоновые кислоты (Julsing, Cornelissen, Bühler, & Schmid, 2008, Martinez et al., 2017).

В последние годы было приложено много усилий для устранения этих ограничений с помощью инженерии белков и реакций.Кроме того, с помощью белковой инженерии был введен новый механизм химической реакции, и появились новые семейства ферментов, а именно пероксигеназы, как многообещающие биокатализаторы, позволяющие избежать некоторых внутренних ограничений P450. Таким образом, в этом обзоре сообщается о последних достижениях, достигнутых в области биокатализа гемовых ферментов в трех основных областях: новых биокатализаторов, новой химии реакций и новых реакторов, направленных на повышение применимости. Особое внимание было уделено избранным примерам 450 s и пероксигеназ, которые оказали большое влияние на исследования в последние годы.

2 ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ГЕНОМНЫХ ДАННЫХ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ НОВЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ ГЕМОВ

Новые гемовые белки для продуктивного биокатализа могут быть выделены из образцов тканей, природных экстрактов и микробных культур с последующим стандартным скринингом активности in vivo. Другой вариант — поиск новых ферментов на основе идентичности последовательностей. Такой подход «от последовательности к функции» часто более эффективен по времени, поскольку белковая последовательность предполагаемого нового фермента легко доступна, а активность и функциональность фермента могут быть протестированы.

До конца 2018 года около

генов были аннотированы как принадлежащие к семейству P450 (база данных генов NCBI). Однако до сих пор в литературе описано только около 2000 белков P450. На рисунке 1 показано расхождение количества геномных последовательностей, аннотированных для P450 за последние десятилетия, депонированных в NCBI, и количества проверенных P450, депонированных в базе данных белков UniProt.

Чтобы заполнить пробел между доступными последовательностями и описанными белками, необходимы инструменты дальнейшей обработки данных и анализа последовательностей, ведущие к развитию многих баз данных прогнозной биоинформатики.Одной из первых доступных баз данных, которая классифицировала, собирала и называла ферменты P450, была «Домашняя страница Cytochrome P450» Дэвида Нельсона. Согласно номенклатуре Нельсона, определенный предел идентичности последовательностей классифицирует P450s в суперсемействах или гомологичных семьях. Существует несколько других специализированных онлайн-баз данных, содержащих информацию о последовательностях различных видов, например, «База данных Arabidopsis P450» или «База данных по цитохрому грибов P450». Сравнение неизвестных последовательностей генов с охарактеризованными кодирующими последовательностями ферментов является многообещающим подходом для получения новых ферментов.Используя выравнивание последовательностей, недавно был идентифицирован новый фермент слияния, CYP505A30, из термофильного гриба Myceliophthora thermophile , имеющий 57% идентичности с CYP505A1 (P450foxy) из Fusarium oxysporum (Baker et al. , 2017). CYP505A30 показал сходные каталитические свойства при гидроксилировании жирных кислот, такие как CYP505A1 и CYP102A1 (BM3). Однако прогнозирование функции только на основе подобия структуры белка является сложной задачей, поскольку объединенная информация о последовательности, структуре и функции часто все еще отсутствует.Это делает неизбежным скрининг активности. Для систематического сравнения белков на интерфейсе «последовательность-структура-функция» была разработана система баз данных BioCatNet CYPED (Gricman, Vogel, & Pleiss, 2015). База данных CYPED объединяет записи базы данных неизбыточных белков, доступные в базах данных белков, таких как PDB или UniProt, с последовательностью гена. Поскольку экспериментально полученная информация об измененных спектрах субстратов и специфичности P450 помогает идентифицировать функциональные роли отдельных остатков и положения, определяющие селективность, литературная информация была добавлена ​​в базу данных (Gricman et al., 2015). Понимание взаимосвязи структура-функция важно не только для предсказания функции, но также является неотъемлемой частью идентификации остатков, определяющих селективность и специфичность, для облегчения рациональных стратегий белковой инженерии.

Аннотированные генные последовательности, кодирующие предполагаемые ферменты P450 (закрашенные символы, левая ось y), а также ряд уже опубликованных и описанных в литературе ферментов P450 (светлые символы, правая ось y).Аннотированные гены были получены из NCBI GenBank полностью секвенированных геномов. Количество проверенных P450 включает аннотированные вручную записи с информацией, извлеченной из литературы, размещенной в базе знаний UniProt. Все значения представляют собой выпущенные записи за год

Анализ полного комплемента цитохрома P450 (CYPome) из организма, о котором известно, что он продуцирует большое количество вторичных метаболитов, также является инструментом для поиска новых ферментов P450 с неизвестными функциями.В рамках проекта по определению функции 18 CYP из actinomyces Streptomyces coelicolor было обнаружено новое подсемейство CYP102, демонстрирующее превращение арахидоновой кислоты с другой регио- и стереоселективностью, как сообщалось ранее для CYP102A1 (BM3) из B. megaterium (Lamb и др., 2010). Этот подход по-прежнему дает большой успех в поиске новых ферментов P450 с различными структурами и функциями. В недавнем исследовании, проведенном Урлахером и соавторами, гетерологичная экспрессия CYPome актиномицетов Streptomyces platensis привела к идентификации нового P450, который можно было оценить как принадлежащий к семейству CYP107L (Worsch et al., 2018). P450 показал высокую активность по превращению нескольких фармацевтических соединений с многообещающим потенциалом применения для препаративного синтеза метаболитов лекарств.

Открытие особого типа P450, который в качестве окислителя предпочитает H ₂ O ₂ , а не NAD (P) H, стало прорывом в области исследований P450. P450s SPα из Sphingomonas paucimobilis и BSβ из Bacillus subtilis были первыми P450, демонстрирующими активность пероксидного шунта для гидроксилирования жирных кислот (Matsunaga, Ueda, Fujiwara, Sumimoto, & Ichihara, 1999). Эти P450 напоминают пероксигеназы по своей способности использовать оба пути, что позволяет легко различать оба семейства. В частности, независимость от восстановленных кофакторов никотинамида (НАД (Ф) Н) упрощает их применение. Однако зависимость H ₂ O ₂ также имеет тот недостаток, что высокое присутствие H ₂ O ₂ в условиях процесса значительно снижает активность и стабильность пероксигеназы. Новое семейство ферментов из царства грибов, неспецифических пероксигеназ (UPO), объединяет каталитический цикл из пероксидаз и шунта пероксида, производного от P450 (Hofrichter, Kellner, Pecyna, & Ullrich, 2015).Кроме того, они имеют такое же разнообразие реакций, что и P450. Первым описанным UPO был Aae UPO из Agrocybe aegerita , и было показано, что он катализирует оксигенацию ароматических, гетероциклических и алифатических соединений (Hofrichter et al., 2015). Кроме того, хорошо зарекомендовавшая себя хлоропероксидаза из Caldariomyces fumago ( Cf CPO) была переклассифицирована как UPO. В 2015 году было обнаружено более тысячи предполагаемых последовательностей UPO в геномах грибов, что указывает на широко распространенное семейство ферментов во всем царстве грибов (Hofrichter et al., 2015). Скудные в настоящее время сведения об их естественном каталитическом выходе по сравнению с P450 таят в себе огромный потенциал для того, чтобы они могли стать многообещающими биокатализаторами для синтеза нового широкого спектра химических соединений, помимо новых ферментов P450.

3 ПОДХОДЫ К БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ И НАПРАВЛЕННОЙ ЭВОЛЮЦИИ ДЛЯ РАСШИРЕНИЯ ДИАПАЗОНА РЕАКЦИЙ

Помимо скрининга штаммов дикого типа и баз данных, область белковой инженерии посредством рациональной модернизации, направленной эволюции или комбинации того и другого продолжает предоставлять новые гемовые биокатализаторы, например, с расширенной субстратной специфичностью или новой стерео- или региоспецифичностью.Эти усилия по инженерии белка в основном нацелены на самодостаточный P450 BM3. Некоторые подходы нацелены на повышение эффективности связывания, поскольку разобщение приводит к потере НАД (Ф) Н и образованию активных форм кислорода, что приводит к нестабильности фермента. Кроме того, были рассмотрены физические свойства, такие как устойчивость к растворителям и термостабильность.

Сила направленной эволюции побудила группу Арнольда не только оптимизировать активность, селективность и стабильность субстрата, но и ввести новые, неестественные реакции в уже существующий разнообразный репертуар реакций P450 (Arnold, 2015).Основным подходом к достижению таких нефизиологических синтетических реакций было использование естественной реакционной способности гем-кофактора и дальнейшее улучшение с помощью белковой инженерии и направленной эволюции. Поскольку карбены и нитрены имеют аналогичную электронную структуру, как и вышеупомянутый аналог природного кислорода оксен, вероятна ферментативная неразборчивость в реакции переноса карбена и нитрена. Основное преимущество образования металл-карбеноид и металл-нитреноид из предшественников азида и диазо по сравнению с естественной системой состоит в том, что не требуется внешний восстановитель, поскольку железо возвращается непосредственно в свое состояние покоя Fe (II).Перенос карбенов через металл-карбеноидные интермедиаты P450 BM3 был впервые продемонстрирован Coelho, Brustad, Kannan, and Arnold, 2013 (Рисунок 2b). Успех в создании высокоактивных карбеноидов металлов основан на использовании синтетических предшественников активированного карбена, таких как этилдиазоацетат (EDA). На первом этапе они смогли показать, что даже свободный гемин может катализировать циклопропанирование стиролов диазоэфирными реагентами. На втором этапе они заменили консервативный цистеин, служащий лигандом гемового железа для белковой основы, на серин или гистидин.Эти мутации привели к сильному улучшению активности, показывая, что скелет фермента и состояние лигирования играют важную роль в активности. Из-за этого обмена активность циклопропанирования сместилась в сторону высоких оборотов (Wang et al., 2014). Сконструированный P450 BM3 с заменой His (T268A-AxH) достиг общего числа оборотов (TTN) 7100 на стадии циклопропанирования для синтеза левомилнаципрана (Wang et al., 2014). Использование серин-замещенного P450 BM3 в системе покоя in vivo клеток Escherichia coli BL21 (DE3) и высокой нагрузки субстрата, циклопропанирование с титром продукта до 27 г / л ^-1 и TTN более 60 000 было возможно (Коэльо, Ван и др., 2013). Синтез циклопропанов в ряду арилзамещенных олефинов в более низком масштабе в граммах также может быть достигнут с помощью сконструированного миоглобина, дополнительно демонстрирующего высокую стереоселективность trans (Bajaj, Sreenilayam, Tyagi, & Fasan, 2016). Эти эффективные биокаталитические системы, демонстрирующие высокое значение TTN для неприродных реакций, открывают новые возможности для устойчивого производства ценных химикатов.

Расширение репертуара естественных реакций P450 на абиологическую реактивность путем направленной эволюции и дизайна. Естественная реакция посредством начального формального переноса оксена (a), P450 BM3 катализирует неприродные реакции переноса карбена (b), перенос нитрена (c), Rma cyt c, катализируемый переносом карбена (d), замещение консервативного железа на Ir ( Me) -PIX (e)

В дополнение к улучшенной активности циклопропанирования через промежуточное соединение железо-карбеноид, также стало возможным внедрение карбеноидов в связи N-H при использовании первичных аминов в качестве партнеров реакции (Wang, Peck, Renata, & Arnold, 2014).Другая реакция, которая к тому времени была ограничена синтетическими катализаторами на основе переходных металлов, — это перенос нитрена, катализируемый сконструированными белками P450 BM3 (рис. 2c). При использовании сульфонилазидов в качестве предшественников нитрена и последующего образования металл-нитреноидов C-H, реакции аминирования были достигнуты с помощью лигированного цистеин-гемом P450 BM3, содержащего мутации в активном центре фермента (Singh, Bordeaux, & Fasan, 2014 ) и P450 BM3 с осевой мутацией Cys – to – Ser (Mcintosh et al. , 2013).В обоих случаях сообщалось об аналогичной эффективности с 388 TTN и 430 TTN соответственно. Используя сконструированный P450 с осевой мутацией Cys – to – Ser, также может быть достигнуто образование сульфимидов и межмолекулярное азиридирование (Farwell, Zhang, Mcintosh, Hyster, & Arnold, 2015). Другой высокоэффективной реакцией переноса нитрена было энантиоселективное C-H амидирование с природным гидроксаматом в качестве предшественника карбонилнитрена для создания β-, γ- и δ-лактамов (Cho, Jia, & Arnold, 2019).Вариант P411 (LSsp3), который изначально был разработан для переноса карбена, был способен синтезировать желаемый β-лактам. Несколько раундов сайт-направленного мутагенеза и порционное кормление LSsp3, экспрессирующего E.coli с предшественником нитрена, дали более 1 миллиона TTN.

Поскольку распространение новых реакций внутри гем-белков ограничено внутренней реакционной способностью железного центра, Хартвиг ​​и его коллеги использовали другой подход замены природного железа на абиологический металл (Key et al. , 2017; Рисунок 2д). Эта комбинация синтетического комплекса переходного металла и основной цепи фермента выигрывает как от широкой реакционной способности, что типично для катализа переходными металлами, так и от селективности фермента. Путем замены консервативного железа в миоглобине и P450 CYP119 на Ir (Me) -порфирин IX (Ir (Me) -PIX) включение карбенов расширилось до широкого диапазона концевых и внутренних алкенов. Ir (Me) -PIX-замещенные варианты CYP119 могут катализировать циклопропанирование различных замещенных стиролов с до 99% ee , выходом 54% и 300 TTN.Также возможно добавление карбенов к внутренним неактивированным алкенам, таким как циклопентен, с образованием циклопропана с выходом 76% и 1300 TTN. Несмотря на высокую и расширенную реактивность, специфичность и селективность к субстрату фермента можно было сохранить.

Еще одним прорывом стало первое сообщение о гем-белке, катализирующем образование связи углерод-кремний в 2017 году, что ранее не было известно для живых организмов (Kan, Lewis, Chen, & Arnold, 2016; Рисунок 2d). Тестируя свободный гемин и панель гемопротеинов для получения кремнийорганического продукта из фенилдиметилсилана и этилдиазопропаноата, Кан и его коллеги обнаружили уже низкое TTN для желаемой реакции, но с низкой энантиоселективностью. Однако было обнаружено, что цитохром c из Rhodothermus marinus ( Rma cyt c) катализирует реакцию с 97% ee . Rma cyt c уже естественным образом содержит гистидин (h59) в качестве аксиальной координации с железом, что обеспечивает высокую беспорядочную активность для переноса карбена через диазопредшественники, как это было показано ранее в исследованиях.Были вставлены дополнительные мутации активного сайта, и замена трех аминокислот привела к 30-кратному улучшению по сравнению с диким типом, достигнув 1500 TTN и с небольшим увеличением оптической чистоты до более чем 99% ee . Более того, авторы смогли показать, что синтез кремнийорганических продуктов также возможен in vivo с использованием биотрансформации целых клеток с гетерологически экспрессируемыми ферментами Rma cyt c в E. coli . Их результаты показали, что ферментативный катализ даже неестественных превращений может превосходить синтетический катализ не только с точки зрения селективности, но и активности реакции.Вторая реакция, внедрение карбена в бор-водородные связи, катализируется тем же ферментом, Rma cyt c (Kan, Huang, Gumulya, Chen, & Arnold, 2017; рис. 2d). Для проведения борилирования Rma cyt c экспрессировали гетерологично в клетках E. coli BL21 (DE3) и целые клетки инкубировали в присутствии комплексов боран-основание Льюиса и этил 2-диазопропаноата. Использование cyt c дикого типа Rma дало TTN 120 и хорошую селективность (70% ee ), которая не могла быть достигнута с другим цитохромом c, цитохромом P450 и свободным гемином.Мутагенез с насыщением сайта в одном положении активного центра, который уже привел к улучшению образования углерод-кремниевых связей, прежде чем усилил каталитическую эффективность Rma cyt c в 16 раз с TTN 1850 и ee 76%. После вставки других мутаций активного сайта оборот и селективность могут быть дополнительно улучшены, давая TTN до 15 300 и ee до 98%. Всего возможно борилирование in vivo 16 борных реагентов в присутствии диазоэфира.

Помимо цитохрома с и P450 в последние годы был опубликован ряд отчетов по инженерии UPO (Gomez de Santos et al., 2019). Подходы направленной эволюции с помощью случайного мутагенеза и перемешивания in vivo действительно нацелены на экспрессию, секрецию и стабильность UPOs в дрожжах, но также улучшают неразборчивость и активность ферментов. Было показано, что сконструированные варианты UPO с высокой эффективностью гидроксилируют свои субстраты до метаболитов лекарств человека (HDM). Мутант Aae UPO, например, достиг TTN 264000, катализируя гидроксилирование пропранолола до 5′-гидроксипропранолола, когда H ₂ O ₂ генерировался in situ метанолом в качестве донора электронов (Gomez de Santos et al. ., 2018). В целом, модифицированные UPO являются чрезвычайно многообещающими биокатализаторами для препаративной химии оксифункционализации.

Вышеупомянутые исследования подчеркивают потенциал гем-белков как отправной точки для неестественных реакций. Можно было показать, что введение всего нескольких мутаций в ключевые позиции может оптимизировать эффективность фермента и селективность для этих реакций, беспрецедентных для ферментативного катализа.

4 НОВЫЕ КОНЦЕПЦИИ БИОРЕАКТОРА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТИ

Помимо поиска и создания продуктивных биокаталитических систем, в последние годы были исследованы стратегии инженерии реакций, позволяющие избежать не только токсичности субстрата или продукта, но и повысить растворимость субстрата.Это привело к разработке новых концепций биореакторов с более высокой производительностью гем-биокаталитической системы (рис. 3).

Особенности биореактора для гемового катализа (а). Схема газодиффузионного электрода (ГДЭ) (б). На катоде кислород восстанавливается до перекиси водорода. Перекись водорода диффундирует к ферменту и превращается в воду. На аноде вода окисляется до газообразного кислорода и ионов водорода. Схема генерации перекиси водорода in situ под действием света (c).Флавинмононуклеотид — фотокатализатор, восстанавливающий кислород до перекиси водорода. Полученная перекись водорода служит косубстратом для биотрансформации. Схема сегментированного проточного мембранного микрореактора (г). Субстрат циклогексан диффундирует через силиконовую мембрану. Цельноклеточный биокатализатор растет в виде биопленки, прикрепленной к внутренней поверхности мембраны, превращающей циклогексан в циклогексанол. Питательные вещества и кислород поставляются сегментированным потоком

Когда для реакции гемового фермента требуется НАД (Ф) Н, регенерация кофактора необходима по причинам затрат.В настоящее время в промышленности используются ферментативные методы регенерации, в основном с использованием формиатдегидрогеназы и глюкозодегидрогеназы. Однако ферментативная регенерация кофактора делает реакцию более нестабильной, а последующие процессы — более сложными (Wang et al., 2017). Для регенерации были разработаны различные другие методы, такие как химический, гомогенно-каталитический, электрохимический, фотокаталитический и гетерологичный каталитический способы. С другой стороны, гемовые ферменты, зависимые от перекиси водорода, полностью исключают необходимость регенерации.Электрохимическая подача H ₂ O ₂ является универсальным подходом для повышения стабильности и минимизации ферментной дезактивации этих кофакторнезависимых ферментов, таких как гемпероксидазы, пероксигеназы и монооксигеназы P450 с высокой активностью шунтирующего пути. Этот электробиотехнологический подход предлагает элегантный способ создания косубстрата для генерации активированного промежуточного гема для реакций переноса кислорода in situ при низких свободных концентрациях H ₂ O ₂ (Schmitz, Rosenthal, & Lütz, 2017).Поскольку электрохимическая реакция зависит от поверхности, большинство усилий при создании новых электробиотехнологических реакторов связано с увеличением отношения площади поверхности электрода к объему реактора. Это может быть достигнуто с помощью трехмерных электродов, таких как уплотненный слой электродных частиц или углеродной пены. В частности, поскольку электрохимическое производство пероксидов водорода в основном достигается за счет катодного восстановления молекулярного кислорода, использование газодиффузионных электродов (ГДЭ) оказалось подходящим (рис. 3b).Использование GDE путем прямого контакта среды биотрансформации и газовой фазы кислорода дало высокую производительность (Krieg, Huttmann, Mangold, Schrader, & Holtmann, 2011).

Альтернативой электрохимическому производству H ₂ O ₂ является непрерывная подача H ₂ O ₂ , реализуемая с помощью каталитических систем генерации in situ, основанных на химиоферментных, ферментативных или световых реакциях (Рисунок 3c; Ni et al. ., 2016, Paul et al., 2014; Zachos et al., 2015). Таким образом, генерация H ₂ O ₂ была общим этапом ограничения скорости и, таким образом, предотвращалось накопление H ₂ O ₂ . Поддерживая низкие уровни H ₂ O ₂ , достигаются более высокая стабильность, повышенная продуктивность и повышенная устойчивость гем-зависимых пероксидаз.

Другой вопрос, который неоднократно поднимался, — это токсичность или ингибирование субстратов и продуктов, которые затрудняют использование гемовых ферментов для промышленных процессов.Эту проблему можно решить с помощью стратегий подачи субстрата на месте (ISSS) и удаления продукта на месте (ISPR). В исследовании Karande et al. (2016) были представлены три различных формата анализа для непрерывной ISSS биотрансформации циклогексана с помощью монооксигеназы P450 (рис. 3d). Циклогексан подавали либо через вторую жидкую фазу, либо через паровую фазу, либо через мембрану в сегментированный проточный биопленочный реактор. Стратегия подачи через паровую фазу снизила присутствие токсичного циклогексана в водном растворе и улучшила стабильность биокатализатора в течение времени реакции, равного 1 часу.Однако подачу субстрата через газовую фазу сложно реализовать в больших масштабах. Поэтому для биотрансформации циклогексана использовали реактор для биопленки с сегментированным потоком воды и воздуха. Этот реактор состоял из кремниевой трубки, в которой формировалась биопленка, а субстрат для биотрансформации подавался диффузией через мембрану кремниевой трубки. Используя эту конструкцию биореактора, был достигнут стабильный функциональный биокатализ с непрерывной подачей кислорода и питательных веществ, а также одновременная ISPR в течение нескольких дней.

Комплексная разработка условий процесса и конструкции реактора позволяет успешно применять биокатализаторы, чувствительные с точки зрения низкой стабильности ферментов, токсичности продукта и субстрата, а также непрерывной подачи электронов и кислорода, как в случае многих гемовых ферментов.

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ НА БУДУЩЕЕ

Оксифункционализация с помощью катализа гем-белка доказала множество преимуществ по сравнению с классическим катализом, таких как превосходная регио- и стереоселективность, эффективность с точки зрения одностадийного преобразования и избежание жестких условий реакции.Однако биотрансформации гем-белка, о которых сообщалось на сегодняшний день, в большинстве случаев далеки от возможности из-за ограничений, таких как низкая активность, сложная окислительно-восстановительная регенерация или низкая эффективность связывания. Хотя были опубликованы выдающиеся примеры развития реакций и процессов гемовых ферментов, упомянутые ограничения и особенно низкая стабильность в условиях процесса часто препятствуют их применению в крупномасштабных процессах. Несмотря на то, что приемлемая стабильность может быть достигнута для небольших экспериментов, более крупные масштабы включают такие условия процесса, как перемешивание и аэрация, которые часто не допускаются этими чувствительными ферментами.Инактивация ферментов в основном вызывается АФК, которые образуются в окислительном цикле (Holtmann & Hollmann, 2016). Следовательно, улучшения могут быть достигнуты за счет оптимизации эффективности связывания, что, в свою очередь, увеличивает стабильность фермента и TTN (Brummund et al., 2016).

Учитывая возможности и вариабельность реакций ферментативного окисления, исследования должны быть сосредоточены на улучшении применения гемового белка. Новые последовательности генома, появляющиеся ежедневно, обладают огромным потенциалом для выявления новых ферментов P450 с новыми субстратными спектрами и специфичностями, а также новых семейств ферментов, таких как UPO грибов.Чтобы сделать белковую инженерию более эффективной по времени, важным шагом является рациональное преобразование последовательности в функцию. Было обнаружено, что несколько остатков, таких как лигирование гема, имеют решающее значение для определения активности в P450. Например, изменение лигирования гема могло бы сместить реактивность в сторону переноса нитрена и карбена, показывая, что понимание последовательности может способствовать предсказанию функций белка. Помимо понимания белков, направленная эволюция с использованием случайного мутагенеза с последующим скринингом, как было показано, приводит к высокоэффективным гемовым ферментам, катализирующим новые и даже неестественные реакции, такие как образование связи углерод-кремний или углерод-бор.Несмотря на то, что открытие и создание продуктивных гем-зависимых биокаталитических систем было продвинуто, некоторые ограничения, такие как токсичность субстратов и продуктов, остаются. Подходы инженерии реакций способствуют преодолению этих основных ограничений за счет пространственного разделения токсичных соединений. Кроме того, очень желательна более высокая загрузка плохо растворимого субстрата, чего можно достичь с помощью технологий ISSS и ISPR, обеспечивающих более высокую производительность.

Уже доказав свою эффективность в качестве индивидуальных подходов, комбинация белковой инженерии и инженерии реакций, а также идентификация новых ферментов с помощью анализа на основе последовательностей кажется многообещающей для создания возможных процессов с достаточной концентрацией конечного продукта.Биокатализ гема останется многообещающей областью, ведущей к новым процессам, равным или превосходящим обычные химические реакции оксигенации.

ССЫЛКИ

• Арнольд, Ф. Х. (2015). Природа химических инноваций: новые ферменты эволюцией. Ежеквартальные обзоры биофизики , 48, 404–410.
• Баджадж, П., Sreenilayam, G., Tyagi, V., & Fasan, R. (2016). Синтез в граммах хиральных циклопропансодержащих лекарств и предшественников лекарств с использованием сконструированных миоглобиновых катализаторов с комплементарной стереоселективностью. Angewandte Chemie International Edition , 55, 16110–16114.
• Бейкер, Г. Дж., Гирван, Х. М., Мэтьюз, С., Маклин, К. Дж., Голованова, М., Уолтем, Т. Н.,… Манро, А. В. (2017). Экспрессия, очистка и биохимическая характеристика флавоцитохрома P450 CYP505A30 из Myceliophthora thermophila . САУ Омега , 2, 4705– 4724.
• Браммунд, Дж., Мюллер, М., Шмитгес, Т., Калузна, И., Минк, Д., Хильтерхаус, Л., и Лизе, А. (2016). Разработка процесса окисления гидрофобных соединений с применением монооксигеназ цитохрома P450 in vitro. Журнал биотехнологии , 233, 143–150.
• Чо, И., Цзя, З., и Арнольд, Ф. (2019). Генетически настраиваемое ферментативное амидирование C-H для синтеза лактама . ChemRxiv ™. https://chemrxiv.org/articles/Genetically_Tunable_Enzymatic_C_H_Amidation_for_Lactam_Synthesis/7711418/1
• Коэльо П. С., Брустад Э. М., Каннан А. и Арнольд Ф. Х. (2013). Циклопропанирование олефинов посредством переноса карбена, катализируемого сконструированными ферментами цитохрома P450. Наука , 339, 307–310.
• Коэльо П. С., Ван, З. Дж., Энер, М. Э., Барил, С. А., Каннан, А., Арнольд, Ф. Х., & Брустад, Э. М. (2013). Серин-замещенный P450 катализирует высокоэффективный перенос карбена на олефины in vivo . Природа Химическая Биология , 9, 485– 487.
• Фарвелл, К. К., Чжан, Р. К., Макинтош, Дж. А., Хистер, Т.К. и Арнольд Ф. Х. (2015). Энантиоселективное азиридинирование, катализируемое ферментами, стало возможным благодаря развитию активного центра цитохрома P450. ACS Central Science , 1, 89–93.
• Гомес де Сантос, П., Канельлас, М., Тивес, Ф., Юнес, С. Х. Х., Молина-Эспеха, П., Хофрихтер, М.,… Алькальде, М. (2018). Селективный синтез метаболита человеческого лекарственного средства 5′-гидроксипропранолола с помощью эволюционирующей самодостаточной пероксигеназы. ACS Catalysis , 8, 4789–4799.
• Гомес де Сантос, П., Сервантес, Ф. В., Тивес, Ф., Плу, Ф. Дж., Холлманн, Ф., и Алькальд, М. (2019). Сравнительный анализ лабораторных исследований неспецифических пероксигеназ для синтеза метаболитов лекарственных препаратов человека. Тетраэдр , 75, 1827–1831.
• Gricman, Ł., Vogel, C., И Плейс Дж. (2015). Идентификация универсальных определяющих селективность положений в монооксигеназах цитохрома P450 путем систематического изучения литературы на основе последовательностей. Белки: структура, функция и биоинформатика , 83, 1593–1603.
• Хофрихтер, М., Келлнер, Х., Пецина, М. Дж., И Ульрих, Р. (2015). Грибковые неспецифические пероксигеназы: гем-тиолатные белки, сочетающие в себе свойства пероксидазы и цитохрома P450.В E. G. Hrycay, & S. M. Bandiera (Eds.), Монооксигеназа, пероксидаза и свойства пероксигеназы и механизмы цитохрома P450. Чам, Швейцария: Springer.
• Холтманн, Д., & Холлманн, Ф. (2016). Кислородная дилемма: серьезная проблема для применения монооксигеназ? ChemBioChem , 17, 1391–1398.
• Юлсинг, М.К., Корнелиссен С., Бюлер Б. и Шмид А. (2008). Гемо-железооксигеназы: мощные промышленные биокатализаторы? Текущее мнение в области химической биологии , 12, 177–186.
• Кан, С. Б. Дж., Хуанг, X., Гумуля, Ю., Чен, К., и Арнольд, Ф. Х. (2017). Генетически запрограммированный синтез хирального органоборана. Природа , 552, 132–136.
• Кан, С.Б. Дж., Льюис, Р. Д., Чен, К., и Арнольд, Ф. Х. (2016). Направленная эволюция цитохрома с для образования связи углерод-кремний: оживление кремния. Наука , 354, 1048–1051.
• Karande, R., Debor, L., Salamanca, D., Bogdahn, F., Engesser, K. -H., Buehler, K., & Schmid, A. (2016). Непрерывное окисление циклогексана до циклогексанола с использованием новой монооксигеназы цитохрома P450 из Acidovorax sp.CHX100 в рекомбинантных биопленках P. taiwanensis VLB120. Биотехнология и биоинженерия , 113, 52–61.
• Ки, Х. М., Дидио, П., Лю, З., Ра, Дж. Ю. Э., Назаренко, А., Сейедказеми, В.,… Хартвиг, Дж. Ф. (2017). Помимо железа: иридий-содержащие ферменты P450 для селективного циклопропанирования структурно различных алкенов. ACS Central Science , 3, 302–308.
• Криг, Т., Хюттманн, С., Мангольд, К.-М., Шрадер, Дж., И Хольтманн, Д. (2011). Газодиффузионный электрод как новая реакционная система для электроферментного процесса с хлоропероксидазой. Зеленая химия , 13, 2686–2689.
• Лэмб, Д. К., Лей, Л., Чжао, Б., Юань, Х., Джексон, К. Дж., Уоррилоу, А. Г. С.,… Уотерман, М. Р. (2010). Streptomyces coelicolor A3 (2) белок CYP102, новая гидроксилаза жирных кислот, кодируемая как гемовый домен без N-концевого окислительно-восстановительного партнера. Прикладная и экологическая микробиология , 76, 1975–1980.
• Мартинес, А. Т., Руис-Дуэньяс, Ф. Дж., Камареро, С., Серрано, А., Линде, Д., Лунд, Х.,… Алькальде, М. (2017). Оксидоредуктазы на пути к промышленным биотрансформациям. Успехи биотехнологии , 35, 815–831.
• Мацунага, И., Уэда, А., Фудзивара, Н., Сумимото, Т., и Итихара, К. (1999). Характеристика продукта гена ybdT Bacillus subtilis : β-гидроксилирующего цитохрома P450 новой жирной кислоты. Липиды , 34, 841–846.
• Макинтош, Дж. А., Коэльо, П. С., Фаруэлл, К. К., Ван, З. Дж., Льюис, Дж. К., Браун, Т. Р., и Арнольд, Ф. Х. (2013). Энантиоселективное внутримолекулярное C-H-аминирование, катализируемое сконструированными ферментами цитохрома P450 in vitro и in vivo. Angewandte Chemie International Edition , 52, 9309–9312.
• Ни, Ю., Фернандес-Фуэйо, Э., Бараибар, А. Г., Ульрих, Р., Хофрихтер, М., Янасе, Х.,… Холлманн, Ф. (2016). Катализируемые пероксигеназой реакции оксифункционализации, которым способствует полное окисление метанола. Angewandte Chemie International Edition , 55, 798–801.
• Пол, К.Э., Чуракова Э., Мауриц Э., Гирхард М., Урлахер В. Б. и Холлманн Ф. (2014). Образование h3O2 для пероксигеназ P450 in situ. Биоорганическая и медицинская химия , 22, 5692– 5696.
• Шмитц, Л. М., Розенталь, К., и Лютц, С. (2017). Электробиотехнологический синтез на основе ферментов. В Ф. Харниш и Д. Холтманн (ред.), Биоэлектросинтез (достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии).Берлин, Гейдельберг: Springer.
• Сингх Р., Бордо М. и Фазан Р. (2014). P450-катализируемое внутримолекулярное sp3 C – H-аминирование арилсульфонилазидными субстратами. ACS Catalysis , 4, 546–552.
• Ван, X., Саба, Т., Ю, Х. Х. П., Хоу, Р. Ф., Андерсон, Дж. А., и Ши, Дж. (2017). Регенерация кофактора NAD (P) H по гетерогенным путям. Chem , 2, 621–654.
• Ван З. Дж., Пек Н. Э., Рената Х. и Арнольд Ф. Х. (2014). Катализируемое цитохромом P450 внедрение карбеноидов в связи N-H. Химические науки , 5, 598–601.
• Ван, З. Дж., Рената, Х., Пек, Н. Е., Фаруэлл, К. К., Коэльо, П. С., и Арнольд, Ф. Х. (2014). Повышенная активность циклопропанирования цитохрома Р450, связанного с гистидином, делает возможным энантиоселективный формальный синтез левомилнаципрана. Angewandte Chemie International Edition , 53, 6810–6813.
• Уорш, А., Эггиман, Ф. К., Гирхард, М., Бюлер, К. Дж., Тивес, Ф., Чая, Р.,… Урлахер, В. Б. (2018). Новая монооксигеназа цитохрома P450 из Streptomyces platensis напоминает активность человеческих лекарств, метаболизирующих P450. Биотехнология и биоинженерия , 115, 2156–2166.
• Захос, И., Гассмайер, С. К., Бауэр, Д., Зибер, В., Холлманн, Ф., и Курист, Р. (2015). Фотобиокаталитическое декарбоксилирование для синтеза олефинов. Chemical Communications , 51, 1918–1921.

Всестороннее исследование геномных изменений при раке желудка выявляет рецидивирующие неоантигены как потенциальные терапевтические мишени

Иммунотерапия, направленная против специфичных для рака неоантигенов, полученных из немолчащих мутантов, является многообещающей индивидуализированной стратегией лечения рака.Неоантигены, общие для всех пациентов, можно использовать в качестве общедоступного ресурса для разработки терапии на основе Т-клеток. Чтобы определить потенциальные общедоступные неоантигены для терапии рака желудка (РЖ), в это исследование были включены 74 пациента с РЖ. В сочетании с когортными исследованиями TCGA и другими опубликованными исследованиями, данные полного экзома-секвенирования у 942 пациентов с GC были использованы для обнаружения соматических мутаций и прогнозирования неоантигенов, общих для пациентов с GC. Характер мутаций в нашем исследовании и когорте TCGA сопоставим, и C> T является наиболее распространенной заменой.Количество неоантигенов было значительно выше у пожилых пациентов (возраст ≥60) по сравнению с более молодыми пациентами (возраст <60) как в этом исследовании, так и в когорте TCGA. Рецидивирующие неоантигены были обнаружены в восьми генах ( TP53 , PIK3CA , PGM5 , ERBB3 , C6 , TRIM49C , OR4C16 и KRAS ). Связанные с неоантигеном мутации PIK3CA (p.h2047R) и TP53 (p.R175H) распространены для нескольких типов рака, что указывает на их потенциальное использование.В целом, наше исследование иллюстрирует комплексный геномный ландшафт GC и предоставляет рекуррентные неоантигены для облегчения дальнейшей иммунотерапии.

1. Введение

Рак желудка (РЖ) является ведущей причиной смерти от рака во всем мире и особенно распространен в странах Восточной Азии [1, 2]. Химиотерапия и лучевая терапия — традиционные методы лечения ГК. Несмотря на усиление эрадикации Helicobacter pylori и ранний скрининг рака, 5-летняя общая выживаемость для GC во всем мире все еще ниже 30% [3].

С развитием биопрепаратов иммунотерапия произвела революцию в онкологии, воздействуя на иммунную систему хозяина. Существует много способов иммунотерапии, таких как ингибиторы иммунных контрольных точек (ICI), противораковые вакцины и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL), специфичные для мутантного антигена [1, 4-7]. Недавние исследования подчеркнули роль опухолеспецифических неоантигенов в иммунотерапии рака, продвигая персонализированные вакцины и клеточную терапию, основанную на соматических мутациях рака [8, 9]. В нескольких исследованиях неоантигены использовались в качестве мишеней в основанной на Т-клетках иммунотерапии для лечения меланомы [10, 11], злокачественных глиом [12], рака яичников [13] и рака груди [4].Хотя иммунотерапия на основе неоантигенов использовалась при многих раковых заболеваниях, насколько нам известно, они не использовались при РЖ.

Появление технологии секвенирования следующего поколения быстро расширило наше понимание генетической основы GC, и многие исследования предоставили полезную информацию о перекрестной проверке [14–20]. Однако большинство этих исследований было сосредоточено на механизме генных мутаций и туморогенеза, но не касалось неоантигенного ландшафта ГК, и размер выборки для одного исследования был ограничен.Чжоу и его коллеги проанализировали неоантигены у 32 пациентов с ГК. Однако из-за ограничений размера выборки и методов обнаружения в исследовании не было обнаружено общих неоантигенов среди пациентов с РЖ [21]. Поэтому, чтобы продвигать иммунотерапию ГК на основе неоантигенов, мы объединили 74 образца этого исследования с опубликованными данными секвенирования, чтобы получить 942 образца и провели самое крупное исследование неоантигенного ландшафта ГК на сегодняшний день.

2. Материалы и методы

2.1. Геномные данные GC

Это исследование было одобрено этическим комитетом больницы Union Medical College при Медицинском университете Фуцзянь и проводилось в соответствии с утвержденными руководящими принципами. Все пациенты подписали информированное согласие перед госпитализацией. В общей сложности были предоставлены образцы рака и прилегающих нормальных тканей из 75 случаев с клинической патологической информацией, и 74 из них (далее — когорта Фуцзянь) прошли контроль качества для создания библиотеки и секвенирования (таблица 1).Кроме того, были загружены все соматические мутации, включая замены одиночных нуклеотидов и короткие вставки / делеции (инсерции) из самых последних публикаций (таблица 1 и дополнительные таблицы S1-S2), представляющие другие шесть географически различных когорт исследований, а также данные о мутациях. 942 пациента были в конечном итоге получены для комплексного анализа.

9099 9099 3 72 9099 9099 9099 9099 9099 9099 9099 9099 9099 76 Характеристики Фуцзянь TCGA Все ≧ 60 46 306 589 NA 0 5 35 Пол Внутренняя 22 158 315 NA 0 0 20 429 диффузный 28 305 смешанный 10 0 24 NA 4 180 184 7 59 96 Стадия II 7 130 200 Стадия III 51 183 418 44 178 NA 0 27 50 Дифференциация Плохо 51 Плохо 51 Плохо 51 — 21 Умеренный 0 — 32 9 0998 NA 3 443 753 Расположение Antrum 17 162 286 Кардиа 22 62 175 Прочие 4 46 59 NA

NA, не доступен.

2.2. Конвейер для анализа соматических мутаций и прогнозирования неоантигенов

Данные секвенирования когорты Фуцзянь были обработаны с помощью SOAPnuke [22] и сопоставлены с эталоном человеческого hg19 с помощью Edico (http://edicogenome.com/dragen-bioit-platform), а затем MuTect [23] и Varscan2 [24] были использованы для обнаружения соматических snv и инделей соответственно. Мутации с частотой> 0,5% в общих базах данных мутаций (база данных 1000 геномов, база данных Exome Sequencing Project 6500, база данных dbSNP и база данных Exome Aggregation Consortium) были отфильтрованы.Последние мутации были аннотированы с помощью ANNOVAR [25] и преобразованы в формат MAF с помощью Maftools [26] для дальнейшего статистического анализа и визуализации. Некоторые сайты мутаций были выбраны для проверки масс-спектрометрии, и уровень проверки составил 94% [27].

HLA-генотипирование фуцзянской когорты было обработано с помощью Polysolver [28], с предыдущим картированием bam-файла в качестве входных данных. Данные 408 образцов TCGA, содержащих информацию о HLA, были загружены из базы данных dbGAP. Затем для прогнозирования неоантигенов с помощью NetMHC [29], NetMHCpan [30], PickPocket [31], PSSMHCpan [32] и SMM [33].Пептиды должны удовлетворять следующим трем критериям: (1) длина от 8 до 11 меров; (2) аффинность IC50 <500 нМ по крайней мере в двух инструментах; (3) и показатель аффинности пептида мутационного типа (МТ) меньше, чем у пептида дикого типа (WT).

2.3. Статистический анализ

Статистический анализ был проведен R studio, и значимость была определена с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона или точного критерия Фишера, когда это было необходимо. Когда он определяется как значительный.

3.Результат

3.1. Интегрированный ландшафт мутаций пациентов с GC

Мутации GC в когорте Фуцзянь были идентифицированы, и ландшафт показан на рисунке 1. Всего существует 10 607 соматических snv и 511 соматических инделей (инсерций и делеций) со средним значением 66 мутаций. по образцам. Переход C> T является основным типом мутаций, что согласуется с TCGA и предыдущими сообщениями [19, 34]. Для прогнозирования неоантигенов использовались «тихие» snv, включая 6 857 миссенс-мутаций, 463 бессмысленных мутаций, 9 непрерывных мутаций и 212 мутаций в сайте сплайсинга.

Для комплексного анализа 942 образцов GC наиболее часто мутируют гены TP53 , TTN , MUC16 , LRP1B , SYNE1 и CSMD3 (рисунок S1). Несколько других генов-драйверов рака, таких как ARID1A , FAT4 и PIK3CA , также мутировали более чем в 10% образцов GC. Интересно, что мы обнаружили, что пять генов были мутированы исключительно с TP53 , включая CDh2 , KMT2D , RYR1 , PIK3CA, и ARID1A (точный тест Фишера, Рисунок S2).Об обратной взаимосвязи между ARID1A и TP53 сообщалось ранее [35], что указывает на разные механизмы возбуждения рака. CDh2 , KMT2D , RYR1 и PIK3CA также были согласованно мутированы с ARID1A (точный тест Фишера, Рисунок S2), что позволяет предположить, что канцерогенный механизм образцов GC, несущих мутации в этих генах, аналогичен но отличается от образцов, несущих мутацию TP53 .

3.2. Неоантигенное профилирование пациентов с ГК

Чтобы изучить неоантигенное профилирование ГК, мы прогнозируем неоантигены для когорты Фуцзянь и когорты TCGA, используя по отдельности неслышные точечные мутации. Количество неоантигенов в когорте Фуцзянь варьировалось от 0 до 753 со средним значением 76. Всего 408 образцов GC из TCGA были использованы для прогнозирования неоантигенов. Число неоантигенов колебалось от 2 до 15268, при среднем значении 193. Причина, по которой количество неоантигенов в TCGA больше, чем в когорте Фуцзянь, может заключаться в том, что образцы содержат больше мутаций.

Затем мы хотим знать, несут ли значительно мутировавшие гены (SMG) больше неоантигенов. Результаты показывают, что SMG могут продуцировать больше неоантигенов (рис. 2 (а)), таких как TP53 , TTN , MUC16 и ARID1A , что указывает на то, что эти гены могут нести потенциальные сайты нацеливания на опухоль. TP53 , имевшие немые мутации в 212 (48,5%) образцах TCGA и 35 (47,3%) образцах Фуцзянь, соответственно, продуцировали наибольшее количество неоантигенов в двух когортах, при этом 89 и 13 образцов содержали неоантигены, соответственно. MUC16 — это ген, который положительно связан с мутационной нагрузкой опухолей и может кодировать опухолевый антиген CA-125. Считается, что мутация MUC16 связана с лучшим прогнозом [3]. В двух когортах этого исследования ген MUC16 также продуцировал множество неоантигенов.

Далее мы сравнили корреляцию между количеством неоантигенов и немолчащими мутациями в когортах TCGA и Фуцзянь. Результаты показали, что в обеих когортах количество неоантигенов значимо коррелировало с количеством немых мутаций, а коэффициенты корреляции Спирмена равнялись 0.92 () и 0,88 () соответственно (Рисунки 2 (б) и 2 (в)).

3.3. Сравнение неоантигенов в разных подтипах и когортах GC

Затем мы сгруппировали образцы по возрасту, полу, типу Лорен, стадии и месту возникновения и подсчитали различия в количестве неоантигенов между разными подгруппами. Мы обнаружили, что пациенты старше 60 лет имеют больше неоантигенов, чем пациенты моложе 60 лет (критерий суммы рангов Вилкоксона). Мужчины, как правило, несут больше неоантигенов, чем женщины, но не имеют статистической значимости (критерий суммы рангов Вилкоксона, рисунки 3 (a) и (b)).Не было значительных различий в нагрузке неоантигеном между разными типами Лорен, стадиями и разными местоположениями (Рисунки 3 (c) –3 (e)). Такая же тенденция наблюдалась и в образцах TCGA.

Zhou et al. обнаружили, что 54 гена могут продуцировать неоантигены по крайней мере в трех образцах когорты Чжэцзян [21]. В когортах Fujian и TCGA было обнаружено 2855 и 15 791 ген, несущих неоантигены, и 73 и 9480 гена были обнаружены по крайней мере в трех образцах соответственно. Сравнивая три когорты, мы обнаружили, что большая часть генов может быть покрыта когортами TCGA и Fujian (рис. 3 (f)).На уровне неоантигенов в когорте Чжэцзян не было обнаружено неоантигенов, общих для пациентов с РЖ. Два и 486 неоантигенов появились по крайней мере в двух образцах в Фуцзянь и TCGA, соответственно. По той причине, что когорта Чжэцзян не нашла общей последовательности неоантигенов среди образцов GC, мы предполагаем, что это может быть связано с тем, что размер когорты Чжэцзян слишком мал, и они используют только программное обеспечение NetMHCpan для прогнозирования неоантигенов в своих исследованиях, но программное обеспечение может предсказывать только относительно небольшой набор аллелей HLA класса I [30, 32], поэтому существуют некоторые ограничения в предсказании неоантигенов.

3.4. Неоантигены, общие для пациентов с ГК

Всего в образцах Фуцзянь и TCGA было обнаружено 74864 неоантигена, из которых 549 были обнаружены как минимум в 2 образцах (всего 61 неоантиген был разделен между когортами TCGA и Фуцзянь). Восемь ведущих генов, ассоциированных с неоантигенами, были PGM5 , TP53 , TRIM49C , PIK3CA , ERBB3 , C6 , OR4C16 и KRAS соответственно (Таблица 2). Если рассматривать эти неоантигены как панель, она может охватывать около 15.8% от общего количества 482 образцов. В настоящее время 10–20 раковых неоантигенов обычно синтезируются in vitro и используются в Т-клеточной иммунотерапии [11]. Поскольку эти неоантигены могут охватывать определенную часть популяции GC, мы полагаем, что эти повторяющиеся неоантигены GC имеют потенциальную ценность для клинического применения.

26 Ген Изменение AA Freq1 Freq2 Freq3 HLA типы 51 HLA-A02: 30; HLA-A02: 01; HLA-A02: 03; HLA-A02: 05; HLA-A02: 06; HLA-A02: 07; HLA-C03: 03 TP53 R175H 8 25 162 HLA-C07: 02; HLA-C07: 01; HLA-A68: 01; HLA-A02: 03 TRIM49C S327R 7 10 17 HLA-B35: 03; HLA-C06: 02; HLA-C12: 03; HLA-C07: 01; HLA-C07: 02; HLA-B27: 08; HLA-B07: 02; HLA-A02: 01; HLA-B27: 05; HLA-B57: 01; HLA-A32: 01; HLA-A11: 01; HLA-A31: 01 PIK3CA h2047R 5 24 298 HLA-C07: 02; HLA-C07: 01; HLA-A30: 01; HLA-B58: 01; HLA-B57: 01; HLA-A33: 03; HLA-A68: 01 TP53 R273H 5 16 145 HLA-A02: 01; HLA-A02: 07; HLA-A02: 17; HLA-A68: 01 KRAS G13D 5 15 78 HLA-A02: 01; HLA-A11: 01; HLA-A68: 01 ERBB3 V104M 5 11 33 HLA-C06: 02; HLA-B08: 01; HLA-C07: 01; HLA-A30: 01; HLA-C12: 03; HLA-B35: 01; HLA-A30: 02; HLA-A68: 01; HLA-B07: 02; HLA-A03: 01; HLA-C07: 02; HLA-A02: 01 C6 K817T 4 5 9 HLA-C03: 04; HLA-C07: 01; HLA-C03: 03; HLA-C12: 02; HLA-A02: 01; HLA-C02: 10; HLA-A24: 02; HLA-B35: 01; HLA-B15: 03; HLA-A31: 01 KRAS G12D 4 16 430 HLA-A02: 01; HLA-C05: 01; HLA-A02: 06; HLA-A11: 01; HLA-A03: 01; HLA-B07: 02 TP53 R282W 4 14 97 HLA-C03: 03; HLA-A11: 01; HLA-A03: 01; HLA-B07: 02; HLA-A68: 01 OR4C16 S135R 4 6 8 HLA-B37: 01; HLA-A02: 06; HLA-A02: 01; HLA-B15: 01; HLA-C03: 03; HLA-B27: 05; HLA-A03: 01; HLA-C07: 02; HLA-A24: 02

Мы обнаружили, что мутации, соответствующие высокочастотным неоантигенам в образцах Фуцзянь и TCGA, были в основном сайтами с высокой частотой мутаций во всех 942 образцах GC и пан-раке TCGA (Таблица 2, Freq1, Freq2 и Freq3 соответственно).Хотя не все образцы могут получить информацию HLA, мы полагаем, что эти неоантигены также являются потенциальными опухолеспецифическими неоантигенами в других образцах GC.

3.5. Неоантигены, связанные с горячими точками, которые могут быть потенциальным источником мишеней иммунотерапии при ГЖ и пан-раке

Для дальнейшего изучения потенциального значения этих высокочастотных неоантигенов мы сосредоточили наше внимание на мутации R175H ( TP53 ), h2047R ( PIK3CA ) и G12D ( KRAS ), потому что эти сайты могут не только продуцировать повторяющиеся неоантигены (частота более 4 случаев в 482 образцах), но также имеют высокие частоты мутаций в когорте панк-рака TCGA.

TP53 является наиболее распространенным мутировавшим геном-супрессором опухоли при GC и других формах рака, а мутация TP53 R175H, как известно, является канцерогенной [36], которая расположена в ДНК-связывающем домене белка TP53 (рис. 4 (а)). ). Мутация R175H имеет ряд побочных эффектов, таких как снижение активации мишени TP53 , вмешательство в активацию дикого типа TP53 , что приводит к устойчивости к апоптозу, снижению стабильности генома и способствует онкогенезу и миграции клеток [ 37, 38].В когорте больных раком TCGA (почти первичный рак, n = 11 160) мутация произошла у 162 (1,5%) человек. Точно так же мутация является горячей точкой при метастатическом раке. В исследовании MSK-IMPACT более 10 000 метастатических раковых опухолей [39] мутация встречалась более чем в 2% при девяти раковых заболеваниях и 7,2% при раке пищевода и желудка (рис. 4 (b)). Хотя R175H широко распространен при многих формах рака, лекарственного средства для этой мутации не существует. Таким образом, мы считаем, что мутация может быть потенциальной мишенью для иммунотерапии Т-клетками при различных типах рака.

Мутации PIK3CA в основном обнаруживаются в ВЭБ-положительных ГК [16], и это один из генов-драйверов рака. PIK3CA h2047R представляет собой мутацию увеличения функции, локализованную в области киназы (рис. 4 (c)), онкогенный и наиболее часто встречающийся при раке груди [40, 41]. Частота этой мутации при раке поджелудочной железы TCGA составила 298 (2,7%) и более 2% при множественных метастатических типах рака в когорте MSK-IMPACT (рис. 4 (d)). PIK3CA Ген имеет много форм мутаций на этом сайте (включая h2047R, h2047Y и h2047L).Чжоу и др. сообщили, что мутация h2047Y может продуцировать опухолеспецифический неоантиген у пациента с GC [21]. Однако стоит отметить, что мутация h2047R является основной формой мутации PIK3CA как в когорте TCGA GC, так и в когорте панк-рака MSK. Для пациентов с раком груди, несущих мутацию, существуют целевые препараты против мутации, такие как Алпелисиб и Фулвестрант [42]. Как упоминалось ранее, мутация PIK3CA и мутация TP53 являются исключительными для GC, поэтому для пациентов с отрицательной мутацией TP53 может быть вариантом Т-клеточная иммунотерапия на основе PIK3CA h2047R, а также потенциальный выбор для груди. рак или другие виды рака, устойчивые к таргетным лекарствам.Кроме того, KRAS Gly12 (включая G12V, G12C и G12D) также является классической мутацией рака, и частота мутаций этого сайта при метастатическом раке поджелудочной железы и аппендикса составляет более 20% [39]. И Чароентонг, и Виткевич сообщили о высокой частоте мутации KRAS G12D при раке поджелудочной железы [20, 43]. Фактически, началось первое клиническое испытание этого режима иммунотерапии у онкологических больных HLA-A11: 01 с мутацией KRAS G12V (NCT031).

4. Обсуждение

Перед этим исследованием Zhou et al. опубликовал исследование по предсказанию неоантигенов для GC. Однако в их исследованиях есть некоторые ограничения, которые были устранены в этом исследовании. Во-первых, их исследование включало только 32 образца ГК, и не было обнаружено общих неоантигенов среди пациентов с ГК. Во-вторых, они использовали только программное обеспечение для прогнозирования неоантигенов, недавно было выпущено и обновлено несколько программ для прогнозирования неоантигенов [29–33], и исследования показывают, что сочетание нескольких программ может лучше повысить точность и чувствительность прогнозирования неоантигенов [32].В-третьих, мы обнаружили несколько мутаций, связанных с неоантигенами, со значительными мутациями у пациентов с GC или когорты пан-рака, таких как PIK3CA, h2047R и TP53, R175H, которые не были обнаружены в предыдущих исследованиях. Наконец, мутанты MUC4 были зарегистрированы у 94% (30/32) пациентов в когорте Чжэцзян, но предыдущие исследования в нескольких когортах GC никогда не обнаруживали такой высокой частоты мутаций гена MUC4 [14-19, 34, 35]. Похоже, что их исследование дает очевидные ложноположительные результаты в обнаружении мутаций, и точность результатов обнаружения мутаций будет напрямую влиять на прогностические результаты неоантигенов.

Для рекуррентных неоантигенов, идентифицированных в этом исследовании, существует множество аллелей HLA, которые могут представлять их на поверхности клетки (Таблица 2). Среди них HLA-A11: 01, HLA-A24: 02, HLA-A02: 01 и HLA-C07: 02 в основном появились в китайской популяции [44], что указывает на то, что больные раком с этим HLA-типом в Китае будут потенциальные терапевтические популяции для этих «публичных» неоантигенов. Конечно, до иммунотерапии этими «общедоступными» неоантигенами еще далеко. Во-первых, необходимо экспериментально подтвердить, что эти неоантигены представлены и распознаются Т-клетками.Во-вторых, необходимо убедиться, что клетки нормальных тканей не экспрессируют эти антигены, чтобы избежать неблагоприятных аутоиммунных реакций Т-клеток, атакующих нормальные ткани. Это может быть выполнено с помощью высокочувствительного анализа на основе масс-спектрометрии и серии экспериментов [45].

В этом исследовании, чтобы продвинуть иммунотерапию ГК на основе неоантигенов, мы объединили 74 образца когорты Фуцзянь с опубликованными данными секвенирования, чтобы получить 942 образца и провели самое крупное на сегодняшний день исследование мутации и неоантигенного ландшафта ГК.Во-первых, мы построили наиболее полное мутационное профилирование GC. Примечательно, что мы обнаружили, что пять генов были мутированы исключительно с помощью TP53 , включая CDh2 , KMT2D , RYR1 , PIK3CA и ARID1A (точный тест Фишера, Рисунок S2), четыре из которых ( CDh2 , KMT2D , RYR1 и PIK3CA ) ранее не сообщались. Во-вторых, мы используем комбинацию нескольких программ для обнаружения неоантигенов, избегая ограничений одного программного обеспечения (например, PSSMHCpan [32] может пан-специфично предсказывать пептиды, которые связываются с 4896 аллелями HLA класса I, тогда как NetMHC-4.0 [29] и NetMHCpan-3.0 [30] могут предсказывать только 89 и 2924 аллелей HLA класса I соответственно) [32]. В-третьих, цель этого исследования — не только получить неоантигены GC, но также найти потенциально общие антигены у пациентов с GC и способствовать иммунотерапии GC. Комбинируя когорты Fujian и TCGA, 482 образца GC были предсказаны на наличие неоантигенов, и было обнаружено, что 549 неоантигенов являются общими для образцов. Если рассматривать десять лучших неоантигенов в качестве панели, она может охватывать около 15,8% от общего числа 482 образцов.В настоящее время 10-20 онкоспецифичных неоантигенов обычно синтезируются in vitro и используются в Т-клеточной иммунотерапии [11]. Поскольку эти неоантигены могут охватывать определенную часть популяции GC, мы полагаем, что эти повторяющиеся неоантигены GC имеют потенциальную ценность для клинического применения. Считается, что с развитием технологии идентификации неоантигенов будет обнаружено больше видов и количеств неоантигенов, таких как те, которые продуцируются опухолеспецифическими экспрессируемыми аномальными транскриптами сплайсинга из некодирующих областей генома человека [46], иммунотерапия на основе неоантигенов. будет играть все более важную роль в лечении рака.

5. Выводы

В целом, на основе 942 данных секвенирования полного экзома / генома образцов провинции Фуцзянь и других опубликованных данных, был получен наиболее полный ландшафт мутаций GC. Основываясь на данных о мутациях и информации о HLA, было предсказано несколько повторяющихся неоантиген-связанных мутаций, таких как PIK3CA h2047R и TP53 R175H. Некоторые из этих неоантиген-ассоциированных мутаций также имеют высокую частоту при пан-раке, что указывает на то, что они являются потенциальными мишенями для иммунотерапии пан-рака.

Доступность данных

Данные, представленные в этом исследовании, доступны в архиве нуклеотидных последовательностей CNGB (CNSA: https://db.cngb.org/cnsa; номер доступа CNP0000159). Остальные данные можно получить, связавшись с автором-корреспондентом.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

Вклад авторов

Чао Чен, Цимин Чжоу и Рипин Ву внесли равный вклад.

Благодарности

Мы благодарим отделение патологии больницы Union Medical College при Медицинском университете Фуцзянь за помощь в сборе проб и данных. Мы также благодарим Майкла Дина за его конструктивные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана Critical Patented Project Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь, Китай, в рамках гранта № 2013YZ0002-2, совместный проект Фонда естественных наук и здравоохранения провинции Фуцзянь, Китай, в рамках гранта №2015J01397, Комиссия по науке, технологиям и инновациям муниципалитета Шэньчжэнь в рамках гранта № GJHZ20170314152701465 и Шэньчжэньской научно-технической программы в рамках гранта № JCYJ20170817145845968.

Дополнительные материалы

Дополнительный рисунок S1: мутационный ландшафт образцов 942 GC (рак желудка). Дополнительный рисунок S2: взаимодействия соматических мутаций между генами. Дополнительная таблица S1: шесть опубликованных публикаций о геноме GC, включающих 942 образца GC в этом исследовании.