Ливны транспортная компания: Грузоперевозки Ливны | Рассчитать стоимость доставки груза

Грузоперевозки в Ливны (Орловская область). Доставка груза до Ливны (Орловская область)| ФортунаЛог

Наша транспортная компания уже на протяжении многих лет оказывает услуги по перевозке любых грузов по России и в другие страны. Также компания осуществляет грузоперевозки Москва — Ливны (Орловская область).

Цены на грузоперевозки Ливны (Орловская область) — Москва уточните по многоканальному круглосуточному телефону +7-495-150-29-39 или оставьте заявку на нашем сайте.

Задать вопрос и сделать
заказ можно по телефону:

+7-495-150-29-39

Высококвалифицированные логисты ООО «ФОРТУНАЛОГ ЭЙР ЛАЙНС» готовы предложить своим клиентам несколько проверенных временем маршрутов, а также разработать индивидуальный маршрут, если того требует специфика перевозимого товара, принимая в расчет все пожелания.

Вес, т	До 10000 кг	До 5000 кг	До 3000 кг	До 1500 кг
Объем, м3
Размеры, м	7 м  *  2,4 м	6,1 м  *  2,4 м	5,5 м  *  2,1 м	4 м  *  1,9 м

Карта маршрута

Протяженность маршрута Москва — Ливны (Орловская область) составляет 451 км. Время в пути 7 ч. 51 мин.

Доставка грузов Ливны (Орловская область) — Москва

Со своей стороны наша транспортная компания прилагает все возможные усилия, чтобы перевозка грузов в Ливны (Орловская область) осуществлялась максимально быстро и удобно для наших клиентов. Оформить заявку на грузоперевозку можно прямо на сайте, также в электронном виде или по телефону можно предоставить требуемую информацию о перевозимом грузе. После этого менеджеры нашей компании рассчитают стоимость перевозки по заданным параметрам. В спектр наших услуг также входит прохождение таможенного контроля и подготовка всех сопроводительных документов. Обращайтесь к нам и вы не пожалеете!

Расписание Ливны и район Автобус, маршруты Автобус и последние обновления

Для получения уведомлений о работе компании Ливны и район, пожалуйста, используйте сайт Moovit, который позволяет получать данные в реальном времени о статусе автобуса, задержках автобуса, изменениях в работе автобуса, замене остановок, а также других изменениях в работе маршрута.

Ливны и район это транспортная компания в Орел, отвечающая за маршруты автобуса .

У компании Ливны и район 46 маршрутов автобуса в Орел, а количество остановок автобуса доходит до 511.

Маршруты автобуса этой компании охватывают территорию от севера (Залегощенский Район) с остановкой Совхоз — Васильевка до юга (Должанский Район) с остановкой Долгое — Автостанция.Самая западная остановка это Степановский Поворот (Свердловский Район), а самая восточная остановка — Круглое (Ливенский Район).

Маршруты автобуса компании Ливны и район ходят в Орел повсюду, включая районы Покровский Район, Краснозоренский Район, Должанский Район, Ливны, Залегощенский Район, Свердловский Район, Ливенский Район, Измалковский Район, Верховский Район.

Самый длинный маршрут компании Ливны и район: 554. Маршрут автобуса идет от Орёл, Автовокзал (16) (Орёл) до Ливны — Автостанция (Ливенский Район). Это маршрут протяженностью 146 км, насчитывающий 57 остановок.

Самый короткий маршрут — 210. Этот маршрут автобуса идет от Нагорный Посёлок (Ливенский Район) до Вокзал (Ливенский Район). Его длина составляет 3 км или 6 остановок.

Обратите внимание, что стоимость проезда может меняться в зависимости от нескольких факторов. Пожалуйста, запустите приложение Moovit, чтобы показать тарифы для Автобус. Для получения информации о ценах Автобус и покупки билетов онлайн, пожалуйста, перейдите на сайт Ливны и район.

Ищете расписание маршрутов автобуса компании Ливны и район? Все маршруты и расписания компании Ливны и район в Орел можно найти в Приложении Moovit.

Moovit предоставляет поездки для компании Ливны и район и полезные пошаговые инструкции.

Ливенский фл АО «Пассажирская транспортная компания», ОКПО 71968656

Общие сведения:



Контактная информация:

Индекс: 303800

Адрес: ОРЛОВСКАЯ ОБЛ.,Г ЛИВНЫ,УЛ СЕЛИТРЕННИКОВА, Д 5

Юридический адрес: 302030, ОРЛОВСКАЯ ОБЛ, ОРЁЛ Г, РЕВОЛЮЦИИ УЛ, Д. 1

Телефон: +7 (48677) 2-15-39, +7 (48677) 2-17-05

Факс: +7 (48677) 2-15-39

E-mail:

Реквизиты компании:

Виды деятельности:

Основной (по коду ОКВЭД): 60.21.12 — Пригородные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию

Найти похожие предприятия — в той же отрасли и регионе (с тем же ОКВЭД и ОКАТО)

Дополнительные виды деятельности по ОКВЭД:

50. 20.2	Техническое обслуживание и ремонт прочих автотранспортных средств
50.30	Торговля автомобильными деталями, узлами и принадлежностями
60.21.11	Внутригородские автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
60.21.13	Междугородные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
60.21.14	Международные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
63.21.24	Эксплуатация гаражей, стоянок для автотранспортных средств, велосипедов и т.п.
70.20.2	Сдача внаем собственного нежилого недвижимого имущества
71.21	Аренда прочих сухопутных транспортных средств и оборудования
74.30.7	Технический контроль автомобилей: периодический технический осмотр легковых и грузовых автомобилей, мотоциклов, автобусов и других автотранспортных средств
85. 11.1	Деятельность больничных учреждений широкого профиля и специализированных

Данные из ФГИС «Единый реестр проверок» от 04.01.2022 по ИНН 5751024269:

Номер проверки: 571901394854 Дата начала: 01 декабря 2019 года Тип: Выездная Плановая проверка Статус: Отклонено Орган контроля (надзора): Департамент образования Орловской области Цель: Федеральный государственный надзор в сфере образования Лицензионный контроль Объекты:

Номер проверки: 00170700409213 Дата начала: 01 февраля 2017 года Тип: Выездная Плановая проверка Статус: Завершено Орган контроля (надзора): Управление государственного авиационного надзора и надзора за обеспечением транспортной безопасности по Центральному федеральному округу Цель: Контроль надзор за обеспечением транспортной безопасности согласно Федерального закона от 9. 02.2007 №16-ФЗ Объекты:

Посмотреть информацию о всех проверках (7)

Данные реестра организаций госзакупок по 44-ФЗ:

Данные реестра организаций госзакупок по 223-ФЗ:

Сертификаты соответствия: Исполнительные производства:

Краткая справка:

Организация ‘Ливенский филиал Акционерного общества «Пассажирская транспортная компания»‘ зарегистрирована 16 октября 2002 года по адресу 302030, ОРЛОВСКАЯ ОБЛ, ОРЁЛ Г, РЕВОЛЮЦИИ УЛ, Д. 1. Компании был присвоен ОГРН 1025700765716 и выдан ИНН 5751024269. Основным видом деятельности является пригородные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию. Компанию возглавляет ДИРЕКТОР САМОЙЛОВ АЛЕКСЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ.

Добавить организацию в сравнение

Грузоперевозки Тула Ливны. Сборные грузы, доставка грузов Тула Ливны. Перевозка сборных грузов.

Что происходит за рубежом?

Выступление комиссара Ричард А. Lidinsky, младший 20-й ежегодной Европейской морской организации по праву конференция 7 ноября 2014
24 ноября 2014

Перевозки

Я хотел бы поблагодарить европейское право организации морской пригласили меня выступить сегодня на важную тему, нужна ли мы более униформе международный подход к регулированию. EMLO всегда была живой форум для обсуждения постоянно развивающейся морской индустрии. Так на 20-й годовщины этой организации это только уместно, что мы обратим наше внимание на глобальных вопросах регулирования. В личном плане, я рад сказать, что я был здесь для первой конференции EMLO и за эти долгие годы EMLO посчастливилось иметь должностных лиц и членов, которые были на переднем крае морской нормативной сцене, и я горжусь тем, вклад в эту важную традицию.

Перевозки контейнеров, бытовок

Я хотел бы начать свое выступление сегодня с несколькими предложениями о состоянии дел в нашей отрасли:

Тарифы на перевозку

«Линии, через свои монополистические полномочий, так полностью доминировать грузоотправителей, с которыми они имеют дело, что эти грузоотправители не могут позволить себе, опасаясь возмездия, поставить себя в положение активного антагонизмом по отношению к линии, открыто, предоставив сведения о своих обид . .. различные линии … те же интересы и их организации является эффективной. Грузоотправители наоборот, живут далеко друг от друга, и из-за их различных и часто противоположных интересов может объединить только для взаимной защиты с большим трудом. »

Квартирный переезд

«Общее мнение … является подавляющим в пользу той или иной форме государственного регулирования … перевозчики, занимающиеся внешней торговлей этой страны»

Перевозки рефрижератором

Как вы можете себе представить, выше сладкая музыка для ушей регулятора. Только заметьте раздора является то, что они цитаты из отчета, написанного после Труды комитета палаты по морского флота и рыбного хозяйства при расследовании судоходных Объединение под домашним резолюции 587, и опубликован в 1914 году, так называемой Александр доклада.

Заказать грузовик

Сто лет спустя мы все еще сталкивается с теми же балансировки дилемму. В течение этого века мы стали свидетелями формирования, роста, мертвой хваткой, и в конечном итоге расчленения сильной системы конференц-связи. В своем пути пришли Говоря соглашения, судно Обмен договорам, договорам скорость стабилизации, медленный графиков на пару, и другие изменения схемы сотрудничества носитель. Сегодня мы все были свидетелями формирования и рождения союзов, и в ближайшем будущем, четыре основные из них будет контролировать более 95% международных морских контейнерных trade.i

Заказ бычка

Теперь, когда они находятся на месте и собирается быть в полном объеме, недалеко то время, чтобы увидеть, если альянсы 21-го века решение в создании позитивного вклада в вековой отношений грузовладельца по сравнению с перевозчиком грузов.

Грузоперевозки

Мой собственный опыт в FMC в заключительной конференции дни славы 1970-х годов, в управление порта после этого, на международном морском корпорации, а теперь обратно в FMC, я понимаю, что океанские перевозчики терпеть какое-либо положение, но не признать, что реальные демоны в своей корпоративной существования избыточных мощностей, слабые показатели, неустойчивые GRI-х, нехватка оборудования и перегруженность портов имеют собственного изготовления, а не результатом каких-либо решения со стороны ЕС, КНР, или FMC. На союзов в марте 2013 года, я заявил в статье, которая была опубликована в контейнеризации International, что «создание альянсов по судовладельцев, часто вне досягаемости регулирующего органа любой страны, создал отношение» несущей глобализма «- значение что некоторые операторы хотят взять на себя смысле влияния на внутреннем морских дел стран или даже свою власть, равную или большую, чем нации, что позволяет их корабли заходят в его порты, доступ к морской торговле «. Я не против альянсов даже голосуют за них двоих, но я считаю, чтобы компенсировать и сбалансировать этот новый «Перевозчик глобализм» нам нужен противовес «нормативно-глобализма». Таким образом, он должен прийти, как не удивительно, что я поддерживаю мнение нашего Председателя о том, что нам необходим глобальный подход к регулированию, если мы хотим достичь наших национальных мандатов в регулировании альянсов, обслуживающих международную через воду коммерции каждой основной юрисдикции груза.

Перевозка грузов

На только что завершившейся дискуссии об утверждении 2М альянса, это не было перевозчик или регулятор, а грузоотправитель в Гонконге, кто сделал этот очень задумчивый комментарий:

Транспортировка

«Можете ли вы себе представить, Apple, и Samsung объединяются для производства непатентованных смартфоны, разделяя производственные линии, разделяя поставщиков и обмена клиентов? Этого не произойдет, конечно, потому что в реальном мире существует продукт и ценовой дифференциации, в отличие от сюрреалистического контейнерных перевозок Мир, в котором мелкие линии так напряженно прислушиваюсь к пропаганде крупнейшим, что они просто толпятся в более и более крупные союзы испуганным попытке защитить себя. Исход конечно равна нулю дифференциация и снижение конкуренции … Судоходные линии говорят альянсы включают только оперативная координация, а не коммерческий сговор «. II

Сборный груз

Поезд Москва — Ливны: расписание и цены

Сколько времени занимает поездка из Москвы в Ливны?

Среднее время в пути составляет. Сколько времени нужно, чтобы пересечь 370 км от Москвы до Ливен. Планируя поездку, помните, что возможны задержки. Из-за незапланированных событий ваша поездка из Москвы в Ливны может занять больше, чем.

В какое время суток я могу поехать из Москвы в Ливны?

Если вы предпочитаете путешествовать ночью, то обычно первый рейс из Москвы в Ливны отправляется в.Хотя все может измениться в зависимости от дня, в целом последнее ночное время отправляется в. Если у вас есть некоторая гибкость в течение дня, в который вы путешествуете, вы можете найти другие варианты, доступные вам. Например, некоторые провайдеры могут запускать маршруты только ранним утром в будние дни, когда люди едут на работу. По выходным или праздничным дням часто бывает меньше вариантов.

Какие станции на линии Москва — Ливны?

В зависимости от вида транспорта и провайдера, которым вы решите использовать для своего путешествия, вы сможете вылететь из Москвы со следующих станций: МОСКВА КУРСКАЯ (КУРСКИЙ ВОКЗАЛ).По прибытии в Ливны ваш маршрут будет проходить через все или некоторые из следующих станций: ЛИВНЫ 1. Не все транспортные компании обслуживают каждую станцию, поэтому уточняйте заранее, чтобы точно узнать, куда вас приведет ваш маршрут. Возможно, вам придется воспользоваться другим видом транспорта, чтобы добраться с одной станции на другую или до конечного пункта назначения, когда вы прибудете в Ливны.

Сколько раз в день отправляются вылеты из Москвы в Ливны?

К сожалению, для вашей поездки из Москвы в Ливны не было найдено стыковок. Выбор нового города отправления или прибытия без кардинального изменения маршрута может помочь вам найти связи.

On A Whim — Efrat Livny’s Threshold

On A Whim

Так Эфрат Ливни пришел к созданию инновационного пространства, новой некоммерческой организации и сообщества.

Кейт Баст | Фотограф: Лиза Уилкокс.

Никто не может изменить ситуацию в одиночку. Эфрат Ливни верит в это до глубины души. Она привносит это чувство в Threshold, красочное пространство на Этвуд-авеню, которое она создала для развития как предпринимателей, так и общества.

В число арендаторов

Threshold входят ателье по кузовным работам, в том числе собственный Open Circle Healing Arts Ливни и магазин товаров для здоровья на основе растений. «Аффилированные лица» — единомышленники, другие сотрудники, которые посещают, информируют или проводят мероприятия в пространстве, включают рассказчика, фасилитатора сообщества, маркетолога-стратега, консультанта по дизайну и художника. Для каждого ключевыми являются обмен и сбор мудрости и растущее сообщество.

Десять лет назад Ливни оставила работу руководителем центра биоинформационных ресурсов Биотехнологического центра Университета штата Вашингтон и решила сосредоточиться на своем искусстве — Ливни делает говорящие палочки, в которых используются материалы, собранные ею со всего мира, — и на своей практике работы с телом.Позже, когда ей пришлось закрыть свою студию, она подумала, что это может быть знаком — возможно, она должна была выполнять другую работу. Около двух лет назад Ливни увидела пространство, где сейчас находится Порог, и заперлась в нем «по прихоти», увидев в нем место, где она могла бы заниматься искусством, телом и, возможно, чем-то еще. Может, что-то большое.

И так идея выросла. «Вы переходите этот порог, чтобы найти место для встречи с собой и другими», — говорит Ливни о здании. Войдите в запасной, модернизированный интерьер, и вы почувствуете ощутимое движение, подъем.Он открытый, с высокими потолками. Свет льется и льется повсюду. Яркие стены пробуждают энергию возможности. Это, конечно, художественный замысел Ливни, чтобы сделать Threshold физически и по назначению центром: торговые и офисные помещения ответвляются от центральных мест сбора, и сообщество предназначено как для соединения, чтобы поддерживать их, так и для излучения из Threshold, как спицы в колесе.

Ливны давно ориентируются на холизм. В своем путешествии по раку яичников — она ​​была соучредителем клуба Мэдисон Гильда — своей работой в качестве справочника по раку для других и практикующего терапевта сенсорной терапии с нулевым балансом, она постоянно спрашивает, как мы можем полностью выровняться в наших телах. и умы, наше физическое и умственное пространство.Threshold воплощает эту концепцию, поскольку он также направлен на объединение сообщества и самоактуализации.

«Я хотела сделать что-то помимо обыденного, что способствует синергии между людьми», — говорит она. Она хотела, чтобы «Порог» стал местом для расширения, где вы могли бы выполнять ту тяжелую работу, которая наполняет вас, а не изнуряет. Как общество, Ливни говорит: «Мы ценим делать, а не« быть »достаточно». Но, добавляет она, «действие возникает из бытия. Когда я живу, следующая вещь просто возникает «.

«Threshold — это модель для разжигания общественных дискуссий и проектов», — говорит Ливни.Чтобы создать эту синергию, он проводит все, от семинаров и занятий до встреч, художественных шоу, церемоний, ретритов и частных мероприятий. Темы варьируются от движения и живописи до искусства разговора.

Фактически, идеи Ливни о Threshold получили дальнейшее развитие в разговорах. Берт Ститт познакомился с Ливни в еженедельном кружке или беседе. Она поделилась своей идеей Threshold, а затем Ститт помог ей обсудить ее. Бывший директор по развитию центра города штата Висконсин, Ститт продолжает содействовать стратегическому планированию сообществ и групп.Он также является президентом Центра общественного управления, который помогает некоммерческим организациям в сборе средств и управлении деньгами.

«Я думаю, что она очаровательна тем, что она готова вложить собственные деньги в создание пространства, в котором оно сможет найти свое собственное предназначение и путь», — говорит Ститт. «Мне нравится смелость этой модели и ее готовность выйти и создать ее, и работать с ней», — говорит он.

В рамках развития цели Threshold Ливни запустила серию бесед «Суп для Сирии».Интересно узнать, что думают и чувствуют другие, она пригласила людей собраться за супом, чтобы обсудить мучительный гуманитарный кризис в раздираемой войной стране. На этих собраниях представилось «следующее» Ливни, что-то большое: Ливни и ее муж Кен Баун, а теперь около 80 волонтеров, основали Open Doors for Refugees, некоммерческую организацию, которая помогает местным агентствам по расселению беженцев помогать перемещенным лицам начать строительство. их жизнь здесь.

«Мне стало невозможно не отвечать.Мне кажется, что это Холокост
, и я не могу сидеть сложа руки », — говорит Ливни.

«Я тоже не отсюда. Я не беженец. Я из Израиля и еврейка, — говорит она. Она думает о преследовании ее семьи и других людей от рук нацистов. «Если бы мир не вмешался, меня бы здесь не было. Мой отец пережил Холокост. Его семья не выжила ».

«Быть ​​интегрированным в новое место сложно», — говорит Ливни, и именно поэтому ее Open Doors поддерживает лютеранские социальные службы и еврейские социальные службы, две организации по переселению в Висконсине, помогающие ежегодно 150 беженцам.Волонтеры будут помогать в ключевых областях, таких как ориентация, перевод, жилье, транспорт и помощь беженцам в поиске работы и транспорта. Когда эта история собиралась напечатать, волонтеры Open Doors готовили жилье для недавно прибывшей непальской семьи.

Мэри Флинн, менеджер программы расселения беженцев лютеранской социальной службы в Мэдисоне и Милуоки, говорит, что, помогая беженцам продолжать расти в плане навыков, независимости и комфорта, Open Doors «создает настоящие возможности для интеграции и признания мультикультурности.”

Стремясь повысить осведомленность и увеличить общественную поддержку, Ливни говорит: «Мы обеспокоены политическим климатом в Висконсине и Соединенных Штатах. Организация открыта для участия гражданских, религиозных и других организаций », — говорит Ливны.

Хотя времена неясные — Ливни говорит, что ее беспокоят социальные «страхи перед исламофобией, терроризмом и климатом ужасающих обобщений», — группа эгалитарная, аполитичная и нерелигиозная. «Мы надеемся подготовиться к встрече со всеми беженцами, которые приезжают в Мэдисон», — говорит Ливни.«Наш полный упор делается на человечество и людей».

«Наша надежда, — говорит Ливни, — состоит в том, что, как только люди устроятся, мы сможем интегрировать их в пороговые события — не как людям, которым помогают, а как часть нашего сообщества».

«Я не активист. Я начинаю с малого с того, что меня зовет. Это мировая работа, и мы хотим, чтобы это произошло », — говорит она о Threshold и Open Doors. «Я знаю, что, если бы не это пространство и наше внимание к сообществу, я бы вряд ли взялся за это, и у него не было бы такой четкой траектории.”

«Я просто знал, что мне нужно бросить университет. Я просто знала, что мне нужно открыть Threshold », — говорит Ливни. «Со временем ваша жизнь расскажет вам, почему, и когда вы оглянетесь назад, это станет совершенно логичным».

Полный вперед: открывается долгожданная железная дорога Баку-Тбилиси-Карс

Запуск новой железной дороги на Южном Кавказе может привлечь иностранные инвестиции и стимулировать торговлю, а также стимулировать политическое сотрудничество в регионе, чреватом конфликтом .Но сможет ли железная дорога доставить так, как предполагалось?

После многих лет задержек 30 октября официально открылась железная дорога Баку-Тбилиси-Карс (БТК), соединяющая Каспийский бассейн с восточной Турцией, с последующим доступом к европейской железнодорожной системе.

Главы государств Турции, Азербайджана и Грузии, а также премьер-министры Казахстана и Узбекистана приняли участие в церемонии открытия, проходившей за пределами Баку, на восточной конечной станции маршрута. Президент Азербайджана Ильхам Алиев назвал строительство железной дороги результатом «братства» трех стран.Президент Турции Реджеп Тайип Эрдоган охарактеризовал БТК как «новое предприятие Шелкового пути, инициированное для соединения Азии, Европы и Африки».

Бустеры говорят о том, что Южный Кавказ находится на перекрестке динамичных мировых рынков: Центральная Азия и Китай находятся на востоке, Турция и Европа — на западе, Россия — на севере, а Иран и Ближний Восток — на юге. . БТК позволит перевозить грузы через евразийский континент всего за 15 дней — в два раза быстрее, чем по морю, и вдвое дешевле, чем по воздуху.

БТК создавался более двух десятилетий. Первоначальное планирование строительства железной дороги было результатом войны между Азербайджаном и Арменией из-за Нагорного Карабаха. В 1993 году Турция в знак поддержки Азербайджана закрыла границу с Арменией. Это перерезало то, что в то время было единственным железнодорожным сообщением между Турцией и Кавказом, от Карса до Гюмри, Армения.

БТК десять лет находился в подвешенном состоянии. Затем, в 2007 году, главы государств Азербайджана, Грузии и Турции подписали соглашение о строительстве железной дороги со сроком завершения строительства в октябре 2010 года.

Короткая война Грузии с Россией в 2008 году отбросила проект назад. Поскольку экономика Тбилиси находится в руинах, многие сомневались, что БТК когда-либо будет реализован. Однако в феврале 2016 года на пятой и последней трехсторонней встрече была согласована дата завершения проекта в 2017 году.

«Существует довольно прочный консенсус в пользу проекта, — сказал Гиа Нодиа, политический аналитик из Государственного университета Илии. «Это часть общих усилий по превращению Грузии в незаменимую« транзитную страну », чтобы различные державы (Запад, Турция, а теперь и Китай) были заинтересованы в ее безопасности и стабильности.”

Железная дорога присоединяется к другим региональным инфраструктурным проектам, связывающим Южный Кавказ с Западом, включая нефтепровод Баку-Тбилиси-Джейхан и газопровод Баку-Тбилиси-Эрзурум.

Маршрут БТК призван стать неотъемлемой частью китайской инициативы «Один пояс, один путь» — плана развития инфраструктуры стоимостью почти 1 триллион долларов для расширения наземных, морских и воздушных сетей, связывающих европейские рынки с рынками Дальнего Востока. Грузия и соседний Азербайджан образуют стратегический транзитный коридор, и региональные правительства ожидают, что БТК будет перевозить до 17 миллионов тонн грузов и более 3 миллионов пассажиров ежегодно к 2030 году.

Одной из главных движущих сил БТК является растущая изоляция России с 2014 года. После аннексии Крыма Россия оказалась под международным торговым эмбарго. В ответ Россия заблокировала импорт и транзит продуктов питания из стран, поддерживающих санкции, в том числе европейские продукты, идущие на азиатские рынки.

БТК теперь предлагает маршрут, который позволяет товарам из Европы обходить Россию: грузы могут проходить через Турцию и далее в портовые сооружения на азербайджанском побережье Каспийского моря.Оттуда товары можно переправить по морю в Казахстан, а затем в Китай.

В то время как спрос на железную дорогу был высоким, финансирование было трудным. Многие многосторонние организации, в том числе Всемирный банк, Европейский союз и Европейский банк реконструкции и развития, отказались финансировать проект, во многом из-за того, что железная дорога проходит в обход Армении. ЕС, в частности, работает над открытием старого маршрута между Турцией и Арменией.

Хотя Азербайджан и Турция могли финансировать свои секции, Грузия — нет, особенно после ее экономически катастрофической войны с Россией.

Однако вмешался Азербайджан. Бакинский государственный нефтяной фонд (SOFAZ) предложил Грузии практически беспроцентный кредит. Первый заем, выданный в 2007 году, составлял примерно 200 миллионов долларов под 1 процентную ставку. Деньги должны были покрыть почти все затраты на строительство 178-километрового участка железной дороги Грузии. Но расходы резко возросли, и позже ГНФАР предложил еще один заем в размере около 600 миллионов долларов под 5% годовых.

Азербайджан считает, что железная дорога стоит вложенных средств.«Для Азербайджана БТК превратит страну в региональный транспортный узел», — говорит Махир Гумбатов, исследователь, являющийся соавтором двух книг о железной дороге. Гумбатов утверждает, что транзитные перевозки по железной дороге могут приносить Баку около 300-400 миллионов манатов [177-237 миллионов долларов] годового дохода.

Ожидается, что помимо дополнительных доходов за счет транзитных сборов, железная дорога также будет стимулировать местное производство. Чтобы воспользоваться преимуществами новых возможностей транспортировки, был построен ряд производственных центров.Например, в новом азербайджанском порту Баку в Аляте площадью 20 квадратных километров теперь есть зона свободной торговли, направленная на стимулирование нефтехимической промышленности страны, в частности, пластмасс. Турция создала две зоны свободной торговли вокруг Карса, своего восточного логистического центра. И Грузия тоже создала сеть свободных индустриальных зон на своем участке маршрута.

Грузинские экономисты считают, что новая железная дорога может способствовать снижению торговых издержек. «Было бы здорово иметь больше конкуренции между различными видами транспорта и транспортными компаниями», — сказал Эрик Ливни, директор Международной школы экономики (ISET) при Тбилисском государственном университете.«Результатом станут более низкие транспортные тарифы, лучшее обслуживание и более высокие объемы транзитных грузов».

В конечном итоге ценовая конкурентоспособность могла бы помочь Грузии привлечь транзитную торговлю из других регионов, таких как Россия и Центральная Европа. Если это произойдет, это может дать толчок развитию Поти, главного черноморского порта Грузии, который в настоящее время работает примерно на половину своей мощности. «Если цены упадут, а объемы увеличатся — туда будут ходить более крупные суда, что снизит цены на черноморском участке транспортного пути», — сказал Ливны.

Vintage Livny 20см x 20см Настенная и напольная плитка

График доставки на Рождество и Новый год

Дни доставки

Четверг 23 декабря

Пятница 24 декабря

Среда 29 декабря

Четверг 30 декабря

Пятница 31 декабря

декабря

Дни недоставки

Суббота 25 декабря

Понедельник 27 декабря

Вторник 28 декабря

Суббота 1 января

Понедельник 3 января

Вторник 4 января

Примечание: Если вы не уверены, свяжитесь с нашим клиентом сервисная группа

Плитка будет упакована в термоусадочную пленку на поддоне и доставлена ​​к краю земли на уровне земли (бордюр). Водитель НЕ сможет помочь доставить плитку в вашу собственность по соображениям страховки. Заказы весом до 20 кг будут доставлены курьерской службой.

При заказе образцов плитки вы получите небольшой вырезанный образец размером 10 см x 10 см или 15 см x 15 см.

Надеемся, что вам понравится плитка, купленная в Tiles-Direct. Если вы хотите вернуть нам какие-либо товары, они должны быть возвращены нам в состоянии повторной продажи, в полностью оригинальной картонной коробке / коробке, и ассортимент по-прежнему продается через наш веб-сайт.Заказчик несет ответственность за организацию возврата товара в центр возврата нашего распределительного склада в течение 30 дней с даты доставки. Возврат будет обработан в течение 3-5 рабочих дней после получения нами товаров для повторной продажи.

Взимается комиссия за возврат в размере 10% от возвращенного товара.

Если товары не находятся в состоянии для повторной продажи, когда они возвращаются с нами, Tiles-Direct оставляет за собой право изменить сумму возмещения в зависимости от стоимости товаров для повторной продажи.

Если вы решите вернуть весь заказ, необходимо вычесть затраты на доставку и возврат.

Стоимость доставки зависит от следующих почтовых индексов и будет рассчитана при оформлении заказа, заказы будут доставлены в течение 5-7 рабочих дней по следующим почтовым индексам: GY, HS, IM, IV41, IV42, IV44 — 49, IV55 , IV56, JE, KA27 — 29, KW1 — 14, KW15 — 17, PA21 — 38, PA20, PA40 +, PH9, Ph25 — 20, Ph42 — 44, Ph59, PH50, TR21 — 25, ZE.

Размер и доступ автомобиля

7.5 TONNE TRUCK

18 TONNE TRUCK

Лучший способ определить, есть ли у грузовика доступ к вашему домашнему / рабочему адресу, — это то, есть ли у вас мусоровоз, забирающий извне.

Достаточно широкий доступ — для приема больших грузовых автомобилей (минимум 2,8 м)

Без препятствий — без препятствий, которые могут помешать доставке (например, низко висящие ветки деревьев)

Без уклонов — зона доставки должна быть плоской, а не ровной. крутой склон

Твердая и ровная поверхность — ручные тележки для поддонов работают только на твердых ровных поверхностях, а не на рыхлых поверхностях, таких как трава или гравий

Пространство для разворота — достаточно места для маневрирования и размещения грузовика

Вы ДОЛЖНЫ сообщить, есть ли парковка или временные ограничения в пункте доставки.

Общая информация о доставке

От нашего перевозчика вы получите текстовое сообщение в день доставки с двухчасовым окном доставки. Если есть какие-либо изменения или задержки, вы получите текстовое сообщение.

Если у вас есть какие-либо сомнения относительно состояния доставки, пожалуйста, подпишите товар «НЕ ПРОВЕРЕННО».

Вы должны быть готовы принять доставку в запрошенную дату. Невыполнение этого требования приведет к оплате повторной доставки.

В связи со страхованием и правилами техники безопасности и охраны труда мы не можем доставить товары в собственность клиента.

Мы предлагаем услуги доставки в большинство стран мира. Пожалуйста, отправьте электронное письмо с вашими требованиями.

Для котировок: [email protected]

Для поломок: [email protected]

Программа «Летите в Грузию» для значительного улучшения возможностей авиаперевозок в Грузию и обратно С 1 октября 2016 г.

Как сообщалось ранее, недавняя сделка, заключенная премьер-министром Грузии Георгием Квирикашвили и генеральным директором Wizz Air Овайном Джонсом, привела к тому, что компания приняла решение начать — уже в сентябре 2016 года — базовые операции в Кутаиси и запустить новую услугу дважды или трижды в неделю. из Кутаиси в Берлин, Мюнхен, Милан, Дортмунд, Ларнаку, Софию и Салоники.

В продолжение этой революционной разработки правительство только что обнародовало планы по дальнейшему расширению диапазона и резкому снижению стоимости регулярных рейсов , прямых рейсов между аэропортом Шота Руставели в Тбилиси, обслуживаемым TAV, и пунктами назначения в Западной Европе и Северной Америке. , Китай, Индия и Япония. Новая программа «Полет в Грузию» была представлена ​​и обсуждена сегодня утром на круглом столе с участием представителей грузинской и международной туристической индустрии, премьер-министра Квирикашвили, министра экономического и устойчивого развития Димитрия Кумсишвили, министра финансов Нодара Хадури и главы Национального агентства Грузии. Туристическое агентство Георгий Чоговадзе.

Центральным элементом новой программы являются скидок в размере до 500 долларов США на пассажира, прибывающего в Тбилиси из избранных дорогостоящих пунктов назначения. Формула расчета размера скидки будет основана на стоимости билетов и сумме денег, потраченных на грузинские товары и услуги.

По словам министра Кумсишвили, главного ведущего мероприятия, «цель правительства — привлечь высококлассных туристов, которые, как правило, тратят относительно большие суммы денег на отели, рестораны, магазины и развлечения.Таким образом, «Полет в Грузию» будет стимулировать местных производителей и поставщиков услуг в низкий сезон ».

Скидки будут предлагаться с 30 сентября по 1 июня каждого года, в течение периода, в течение которого вся индустрия гостеприимства Грузии поддерживает очень большие резервные мощности.

Таблица 1: Размер скидки на пассажира, прибывающего в Тбилиси из выбранных пунктов назначения в Западной Европе, Северной Америке и Азии. Стоимость билета Сумма, потраченная на товары и услуги Грузии Более 1500 долларов США 1000–1499 долл. США 500–1000 долларов Более 1000 $ 500 долларов США 300 долларов США $ 100 500–999 долларов США 400 долл. США $ 200 $ 75 До 500 долл. США 300 долларов США $ 100 $ 50

Чтобы легко учесть суммы денег, потраченные отдельными туристами, вместе с небольшими бутылками грузинского вина, пассажирам будет вручена специальная кредитная карта «Потратьте в Грузии» , которая будет выпущена крупными коммерческими банками Грузии в партнерстве с правительство. Карты также предоставят скидки при покупках в участвующих предприятиях. В качестве альтернативы туристы могут записывать свои покупки с помощью простого в установке приложения «Discover Georgia» для iPhone или Android , предоставляющего в качестве дополнительных услуг словарный запас для выживания на грузинском языке, перевод с грузинского на английский и голосовой перевод с английского на грузинский, карты, а также информацию о близлежащих отелях, ресторанах, музеях, а также о развлечениях и достопримечательностях.

В настоящее время ведутся переговоры с крупными европейскими, североамериканскими и азиатскими операторами связи, стремящимися принять участие в программе.Будет выбрано до 10 перевозчиков на основе имеющихся оценок потенциального воздействия на пассажиропоток и доходы от туризма. Среди нынешних лидеров — American Airlines, British Airways, Air France, Japan Airlines, Air China и Fly Emirates.

Выступая по видеосвязи, генеральный директор American Airlines Дуг Паркер отметил, что , «как и многие другие реформы, осуществленные Грузией,« Полет в Джорджию »отражает очень свежий образ мышления, совершенно нестандартный. Американское общество высоко оценивает прозападную позицию Грузии и ее блестящие результаты в проведении антикоррупционных реформ.Уменьшая стоимость поездки, «Полет в Грузию» поможет преобразовать эту признательность в реальные цифры туризма и инвестиций. Мы, как крупнейший американский перевозчик, будем иметь честь служить мостом, соединяющим грузинский и американский народ ».

Георгий Чоговадзе представил анализ GNTA сектора туризма и гостеприимства Грузии, который лежит в основе программы «Летите в Грузию». По его словам, 2015 год был отличным годом для отрасли после временного спада в 2014 году, вызванного глобальным спадом в сфере путешествий и туризма, с одной стороны, и несвоевременными экспериментами Грузии с ограничительной визовой политикой, с другой.

Чоговадзе сообщил, что в 2015 году « человек из общего числа прибывших из-за рубежа установили новый рекорд — почти 6 млн. Однако только 2,23 млн из них были настоящими туристами, то есть людьми, проведшими хотя бы одну ночь в Грузии. Подавляющее большинство прибывших — это транзитных посетителей, посетителей из соседних стран, с которыми Грузия имеет сухопутную границу. Эти транзитные посетители создают нагрузку на инфраструктуру Грузии, практически ничего не внося в ее экономику. Водители грузовиков в их числе платят сбор в размере 250 лари за поездку.Большинство едят хачапури ».

Еще одной проблемой для Грузии, по словам Чоговадзе, является тот факт, что в 2015 году по воздуху прибыло всего 764 тысячи посетителей. Как правило, это туристы, которые остаются и проводят в Грузии. Однако даже в этой группе только 334 тысячи были дорогостоящими туристами из Северной Америки, Западной Европы, Азии и Ближнего Востока. Туристы из этих регионов действительно являются главной целью программы «Лететь в Грузию».

Наконец, основная проблема, которую решает «Лететь в Грузию», — это чрезвычайно высокая концентрация иностранных прибывших за очень короткий период, примерно в июле и августе, с еще одним меньшим пиком в лыжный сезон. Создавая сезонные рабочие места и принося иностранную валюту, такой резкий сезонный пик массового туризма несет в себе множество негативных внешних эффектов, создавая нагрузку на окружающую среду и создавая заторы. Ярко выраженная сезонная картина также отрицательно сказывается на индустрии гостеприимства, снижая стимулы к инвестированию в физический капитал и навыки (которые остаются простаивающими или частично занятыми до 10 из 12 месяцев).

Диаграмма 1: Сезонные колебания количества прибытий по воздуху и заполняемости гостиниц в Аджарии

Чтобы повысить привлекательность Грузии как туристического направления в межсезонье, правительство также планирует инвестировать в водные и грязевые курорты, такие как Цхалтубо, Боржоми / Бакуриани и Ахтала.Опыт Саирме, спа-курорта, возродившегося в 2012 году благодаря государственно-частному партнерству с участием Всемирного банка и частного грузинского бизнеса, свидетельствует о том, что этот сектор обладает огромным всесезонным потенциалом при условии улучшения возможностей авиаперевозок в Грузии. Разработав генеральные планы и маркетинговые «тизеры», правительство в настоящее время ищет иностранных и отечественных инвесторов, заинтересованных в этом секторе.

Премьер-министр Квирикашвили подчеркнул, что «Лети в Грузию» дополняет усилия инвесторов индустрии гостеприимства Грузии.По его словам, «в ближайшие год-два в Грузии откроется более 60 дополнительных гостиниц с общей дополнительной вместимостью почти 40 000 мест. К ним относятся 5-звездочные отели международных брендов, такие как Intercontinental, Hilton Park Inn, Rixos и Hyatt в Тбилиси; Radisson Blue в Цинандали и Crowne Plaza и Babylon Tower в Батуми. Эти инвестиции значительно выиграют от постоянного потока туристов из Западной Европы и Северной Америки ».

Единственным человеком, которого, казалось, беспокоила инициатива нового правительства, был министр финансов Нодар Хадури.Пока другие пели дифирамбы, Нодар спокойно подсчитывал стоимость «Полета в Грузию» для грузинских налогоплательщиков. Если предположить, что количество международных прибытий из премиальных направлений останется на нынешнем уровне около 300 тысяч, стоимость скидок может достигнуть 70 миллионов долларов. Он не мог сразу оценить, принесет ли программа достаточную отдачу от вложенных средств.

«Грузия должна пойти на такой риск», — ответил премьер-министр Квирикашвили. «Наличие регулярного транспортного сообщения с развитыми странами предоставит нам прекрасную возможность укрепить наш бизнес и создать рабочие места.Кроме того, деньги — не единственный критерий оценки достоинств этой программы. Речь идет не только об экономике, но и о налаживании культурных и социальных связей с Европой ».

Взгляды и анализ в этой статье принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают взгляды Международной школы экономики при ТГУ (ISET) или ISET Policty Institute.

Высокопроизводительное предсказание и аннотация бактериальных некодирующих РНК в масштабах всего королевства

Введение

мРНК — это небольшие (обычно 100–300 нуклеотидов в длину) некодирующие бактериальные РНК, которые регулируют экспрессию генов, обычно взаимодействуя с специфические мишени мРНК для модуляции стабильности сообщений и / или доступности машинного перевода [1]. Было показано, что мРНК регулируют широкий спектр клеточных процессов, включая секрецию, восприятие кворума, стрессовые реакции и вирулентность [1], [2]. Почти во всех случаях гены, кодирующие мРНК, расположены далеко от генов, кодирующих их мРНК-мишени, и мРНК: гибридизация мРНК происходит на относительно коротких участках несовершенной комплементарности. Из-за этой ограниченной комплементарности мРНК: мРНК, прогнозирование регуляторной роли подтвержденных мРНК посредством биоинформатической идентификации их мРНК-мишеней оказалось очень трудным.В последние годы было идентифицировано более 200 мРНК у нескольких видов бактерий, включая Escherichia coli , Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes и несколько видов цианобактерий [3]. В то время как разнообразие видов, которые, как известно, кодируют мРНК, предполагает, что эти риборегуляторы являются общими для большинства, если не для всех ветвей дерева эволюции бактерий, предсказания геномных генов, кодирующих мРНК, были выполнены только для 19 из более 550 секвенированных бактериальных штаммов [ 3]. Более того, в настоящее время известна биологическая активность лишь небольшого меньшинства подтвержденных мРНК. Относительная нехватка предсказаний и функциональных аннотаций мРНК представляет собой значительный пробел в нашем понимании бактериальных геномов, транскриптомов и регуляторных путей.

Отсутствие полногеномных аннотаций для генов, кодирующих мРНК, по сравнению с аннотациями для генов, кодирующих белки, тРНК и рРНК, в значительной степени связано с относительной сложностью идентификации локусов, кодирующих мРНК, с помощью биоинформатических подходов.Во-первых, в отличие от генов, кодирующих белок, мРНК не кодируют открытые рамки считывания и, таким образом, не могут быть легко идентифицированы на основе одной только их первичной последовательности. Во-вторых, в отличие от рРНК и тРНК, которые хорошо консервативны среди различных видов бактерий, наиболее известные мРНК консервативны только среди близкородственных видов. Поскольку подавляющее большинство физически подтвержденных к настоящему времени мРНК было идентифицировано только у нескольких видов γ-протеобактерий, предсказание мРНК, основанное исключительно на гомологии с известными мРНК, дало относительно небольшое количество локусов за пределами этого класса [4], [5].

Было разработано несколько биоинформатических подходов для идентификации генов, кодирующих мРНК, в межгенных областях бактериальных геномов путем поиска совместной локализации генетических особенностей, таких как предсказанные Rho-независимые терминаторы транскрипции, промоторы и сайты связывания факторов транскрипции (TFBS), межгенные сохранение среди близкородственных видов и / или консервативная вторичная структура [3]. Хотя эти биоинформатические подходы доказали свою эффективность при идентификации мРНК у нескольких видов, они представляют собой значительные вычислительные проблемы, требующие установления позиционных отношений тысяч индивидуальных генетических характеристик для каждого полногеномного поиска.Несколько вычислительных программ, включая sRNAPredict2 и ISI [6], [7], были недавно разработаны для облегчения эффективного выполнения этих алгоритмов. Однако поиск с использованием этих программ включает сильно фрагментированные протоколы, требующие выполнения множества взаимозависимых программ. Более того, некоторые этапы этих алгоритмов требуют больших вычислительных затрат. Прогнозирование и аннотация генов, кодирующих мРНК, в одном геноме с использованием доступных в настоящее время инструментов, поэтому требует значительного контроля со стороны пользователя и может занять несколько часов; Проведение этих поисков в сотнях секвенированных бактериальных геномов потребовало бы многих тысяч часов контролируемых вычислений.Более того, предыдущие алгоритмы, разработанные для идентификации генов, кодирующих мРНК, обеспечивают небольшую функциональную аннотацию предсказанных локусов и, таким образом, дают мало информации о потенциальных биологических ролях кандидатных локусов.

Чтобы обеспечить высокопроизводительное предсказание и функциональную аннотацию бактериальных генов, кодирующих мРНК, мы разработали SIPHT (протокол идентификации мРНК с использованием высокопроизводительных технологий). SIPHT использует автоматический рабочий процесс и распределительные вычисления, чтобы дать возможность одному пользователю проводить быстрый поиск мРНК по всему королевству — задача, которая была бы непрактичной без этих вычислительных подходов. SIPHT идентифицирует межгенные локусы-кандидаты на основе совместной локализации межгенной консервации и Rho-независимых терминаторов, а затем аннотирует каждый из этих локусов для множества характеристик, предназначенных для предоставления информации относительно силы его предсказания и / или его потенциальных биологических функций. Используя SIPHT, предсказания и аннотации предполагаемых генов, кодирующих мРНК, были выполнены в 932 бактериальных репликонах, что дало 45 599 кандидатов на ранее неаннотированные межгенные локусы. Аннотации этих локусов с помощью SIPHT помогают идентифицировать особенно сильных кандидатов для новых межгенных транскриптов и дифференцировать предполагаемые гены, кодирующие мРНК, и другие типы межгенных локусов, такие как консервативные нетранслируемые области (UTR) мРНК, последовательности межгенных повторов и цис-действующие регуляторные РНК.Функции тысяч предсказанных локусов, включая несколько ранее подтвержденных, но не охарактеризованных малых межгенных транскриптов, предполагаются по их гомологии и / или общей синтении с генами, кодирующими охарактеризованные мРНК или цис-регуляторные элементы РНК, их ассоциации с предполагаемыми TFBS и / или характер их сохранения как в пределах одного генома, так и среди геномов других видов. Эти прогнозы и аннотации для всего королевства, а также веб-интерфейс, позволяющий получить доступ к системе SIPHT, доступны по адресу http: // bio.cs.wisc.edu/sRNA. Интерфейс SIPHT доступен с использованием имени входа и пароля «SIPHT», а результаты поиска будут отправлены на учетную запись moc.liamgreweiverTHPIS, доступную с использованием пароля «reviewer».

Методы

Файлы последовательностей и аннотаций генома и базы данных sRNA

Файлы последовательностей генома и ORF (расширения .fna и .ffn соответственно) и файлы аннотаций (расширения .gbk) были получены из базы данных ftp NCBI. Все последовательности и координаты подтверждены E.coli были получены из базы данных EcoCyc [8] или из опубликованных результатов [9], [10], а также из протестированных, но неподтвержденных локусов E. coli из опубликованных результатов [11], [12]. Последовательности и координаты физически протестированных мРНК в V. cholerae, P. aeruginosa, B. subtilis, L. innocua, P. marinus , S. typhimurium и S. aureus были основаны на опубликованных результатах [7], [13] — [20] и в S. meliloti как по опубликованным результатам [21], так и по неопубликованным результатам (C.Вальверде, J.L., J. Schlüter, J. Reinkensmeier, A. Becker и G. Parisi). База данных, объединяющая координаты этих физически подтвержденных мРНК с координатами предполагаемых некодирующих РНК (нкРНК), полученными из Rfam версии 8.1 [4] и из предсказаний Weinberg et al. [22] был использован для идентификации предсказанных локусов, соответствующих ранее предсказанным и / или экспериментально обнаруженным нкРНК, и для аннотирования гомологии и консервативной синтении с ~ 350 экспериментально подтвержденными или предполагаемыми мРНК и цис-кодируемыми регуляторными РНК.

Идентификация первичной консервативности

Межгенные области (IGR) в каждом репликоне сравнивали с помощью BLASTN 2.0 [9] (с E, установленным на 5e-3, а B и V каждый установлен на 10000) с базой данных, включая все IGR во всех других репликонах за исключением i) IGR от одного и того же штамма; ii) IGR от разных штаммов одного и того же вида (штаммы, имеющие одинаковые названия рода и вида) и iii) IGR с содержанием AT или GC выше 75%. Последний класс IGR был исключен из сравнений BLAST, потому что было обнаружено, что эти IGR производят сопоставление с высокими баллами с IGR у множества неродственных AT или GC-богатых видов, которые вряд ли соответствуют реальной консервации последовательностей.Перекрывающиеся предсказанные локусы, консервативные во множестве репликонов, были проанализированы в один локус; сообщенное значение E и оценка для каждого локуса соответствуют самому низкому значению E и наивысшему баллу этих перекрывающихся кандидатов. При аннотации локусов-кандидатов для сохранения меж- или внутригеномных последовательностей сравнения BLAST проводились не между последовательностями предполагаемых локусов, кодирующих РНК, которые часто были довольно короткими, а между полными последовательностями IGR, содержащими эти локусы. Порог BLAST E в этих сравнениях был установлен на 1e-3.

sRNA_Annotate выполняет поиск выходных данных этого IGR по сравнению с IGR BLAST для определения выравнивания последовательностей, которые перекрывают гены, кодирующие РНК, в последовательностях IGR запроса и базы данных. Два локуса в разных репликонах считаются гомологичными, если для обоих локусов область перекрытия между выравниванием BLAST и локусом составляет i) более 50% всей длины локуса, ii) более 80% от всей длины выравнивания BLAST, или iii) длиннее 75 п.н.Два локуса в одном репликоне считаются гомологичными, если для обоих локусов область перекрытия между выравниванием BLAST и локусами составляет более 20% от всей длины локуса.

Идентификация терминатора

Три программы, RNAMotif, TransTerm и FindTerm, использовались для идентификации предполагаемых Rho-независимых терминаторов. Поиски RNAMotif проводились с использованием RNAMotif v3.0.4 [23] с дескриптором мотива, предоставленным D.J. Эккер. Поиски TransTerm проводились с помощью TransTermHP v2.05 [24]. Программа FindTerm была создана Гилджи Фридлендером на основе эвристического алгоритма, разработанного Рут Хершберг [11].

Идентификация консервативной вторичной структуры

IGR, содержащих кандидатные локусы мРНК, сравнивали с помощью BLAST с базой данных всех IGR. Анализ QRNA проводился с использованием версии 2.0.3d [25] с размером окна (w), установленным на 150, и размером слайда (x), установленным на 50. Сообщается, что предполагаемая мРНК соответствует области консервативной вторичной структуры (обозначенной как «РНК» в столбце «QRNA?» Выходного файла) или кодирующая область (обозначенная как «COD» в столбце «QRNA?» Выходного файла), если эта мРНК перекрывает любую область, предсказанную QRNA для кодирования консервативной вторичной структуры. или консервативная кодирующая последовательность, соответственно, с оценкой выше 5.Если кандидат перекрывает и регион, предсказанный как РНК, и регион, предсказанный как COD, он аннотируется как RNA / COD или COD / RNA, причем предсказание с наивысшей оценкой указывается первым.

Параметры поиска для предсказания мРНК

Во всех поисках максимальное перекрытие между предсказанным локусом и аннотированной ORF было установлено на 65, а максимальный промежуток, разрешенный между 3′-концом консервативной области и 5′-концом предсказанный Rho-независимый терминатор составил 35 п. н. Максимальное значение E, минимальное значение достоверности TransTerm, максимальные оценки RNAMotif и FindTerm, а также минимальная и максимальная длина предсказанных локусов были установлены на следующие значения: Search A-1, 80%, -6, -7, 30 и 600 ; Поиск B- 1e-5, 86%, -7.5, -10, 35 и 550; Искать C-1e-15, 87%, -9, -10, 50 и 500; Найдите D-1e-25, 90%, -10, -11, 60 и 450. Локусы, предсказанные в IGR длиной более 1 т.п.н., были исключены, поскольку было обнаружено, что это значительно увеличивает специфичность. Сообщаемый 5′-конец предсказанного локуса основан на 5′-границе самого короткого HSP, связанного с этим локусом; 3′-конец предсказанного локуса основан на предсказанном 3′-конце связанного с ним терминатора. Таким образом, указанные длины предполагаемых локусов могут значительно отличаться от их фактического размера.Локусы предсказывали перекрытие, но антисмысловые действия по отношению к другим локусам отбрасывались, если 1) они были связаны с терминатором, идентифицированным только одной программой предсказания терминатора, и 2) их антисмысловые локусы были связаны с терминатором, предсказанным более одной программой.

Идентификация TFBS

BioProspector [9], [26] использовался для поиска консервативных мотивов выше генов, которые, как известно, регулируются конкретными факторами транскрипции, для генерации консенсусных последовательностей TFBS. Для согласованных мотивов TFBS переменной длины были сконструированы отдельные матрицы для каждой длины мотива.Списки генов, регулируемых B. subtilis, SigA, SigK и SigG, были получены из DBTBS [27]. Списки генов, регулируемых LexA и Fur, были основаны на их экспериментально определенных регулонах как у грамположительных, так и у грамотрицательных видов (для Fur [28] — [31]; для LexA [32] — [34]). Список генов, регулируемых с помощью σ ⁵⁴ у различных видов, был получен из Barrios et al. [35]. Список генов, регулируемых σ ^E и σ ⁷⁰ в E. coli , был получен из Rhodius et al. [36] и RegulonDB [37] соответственно. Поиск предполагаемых TFBS, соответствующих каждой консенсусной матрице, проводился с использованием Patser v3e. 1 [38]. При поиске Патсера вероятности априорных нуклеотидов , использованные для преобразования матрицы выравнивания в матрицу весов, были установлены равными 0,25 для всех 4 нуклеотидов. Аннотации для Fur, LexA и σ ⁵⁴ сайта связывания были проведены для всех штаммов; для σ ⁷⁰ и SigA — грамотрицательные и грамположительные штаммы соответственно; для SigK и SigG — спорулирующие штаммы; для о ^E , штаммы Enterobacteriaceae .

Определение консервативной синтении

Нуклеотидные последовательности двух ORF, ближайших к 5′-концу, и двух ORF, ближайших к 3′-концу кандидата и ранее аннотированных или подтвержденных локусов, сравнивали с помощью BLAST (E <1e-3). При аннотировании предсказанных локусов как имеющих общую консервативную синтению с известными локусами, кодирующими нкРНК, гомология и консервативная ориентация относительно ЛИБО ближайшего вышестоящего ИЛИ ближайшего нижнего гена ранее идентифицированного локуса считались достаточными. Локусы, имеющие гомологичный геномный контекст и ориентацию только с одной фланкирующей ORF, обозначены в тексте как имеющие «консервативную 3′-синтению» или «консервативную 5′-синтению» соответственно; считается, что локус имеет «консервативную синтению» с другим локусом, ТОЛЬКО если хотя бы один из двух ближайших вышестоящих генов И хотя бы один из ближайших нижележащих генов являются гомологичными И их ориентация относительно этих гомологичных генов с обеих сторон сохраняется.

Результаты и обсуждение

Краткое изложение SIPHT, высокопроизводительной программы для прогнозирования и аннотирования бактериальных генов, кодирующих мРНК

Схема протокола SIPHT показана на рис.Три программы, RNAMotif, TransTerm и FindTerm, используются для предсказания Rho-независимых терминаторов. Консервативные межгенные последовательности идентифицируют путем сравнения IGR интересующего репликона (ROI) со всеми соответствующими IGR из других репликонов с использованием BLAST (см. Методы). Затем sRNAPredictHT идентифицирует гены-кандидаты, кодирующие мРНК, путем поиска в IGR предполагаемых терминаторов, расположенных внутри или непосредственно ниже консервативных последовательностей, и аннотирует этих кандидатов по следующим признакам: координатное положение и ориентация цепи каждого предсказанного гена, кодирующего мРНК; расстояния между геном-кандидатом и генами, фланкирующими его IGR, а также название и ориентацию этих генов; значение BLAST E и оценка связанных с ним консервативных последовательностей; количество и имя (а) репликонов, в которых он сохраняется; какая программа (программы) предсказала связанный терминатор; и соответствует ли она ранее аннотированной регуляторной РНК.После предсказания кандидатов и аннотации с помощью sRNAPredictHT, несколько других программ, включая BLAST, QRNA, Patser и FFN_parse, используются для аннотирования генов-кандидатов по ряду признаков, включая i) гомологию с ранее идентифицированными регуляторными РНК ii) гомологию с другими кандидатами в тех же репликон iii) ассоциация с предполагаемыми сайтами связывания факторов транскрипции (TFBS) iv) консервативная вторичная структура и v) консервативная синтения с ранее идентифицированными регуляторными РНК. Результатом поиска SIPHT является файл с разделителями табуляции, который можно открыть в Excel и который позволяет сортировать локусы-кандидаты по любой из функций, описанных выше.

Схема СИФТ.

Слева показаны два основных этапа протокола SIPHT. Два набора независимых программ в рабочем процессе, которые выполняются параллельно, обозначены заштрихованными овалами. Шаги рабочего процесса, обведенные пунктирными линиями, выполняются не при каждом поиске, а периодически для обновления локальных баз данных.

Как показано в, весь рабочий процесс SIPHT был унифицирован и автоматизирован с использованием DAGMan (Directed Acyclic Graph Manager), планировщика, который координирует выполнение набора программ, которые взаимозависимы из-за ограничений ввода / вывода [39].Управление рабочим процессом SIPHT с помощью DAGMan позволяет пользователю выполнять полный поиск SIPHT в одном репликоне или более чем в тысяче репликонов с помощью одного вызова командной строки. Эта командная строка используется для создания файла конфигурации, к которому обращаются различные программы рабочего процесса. Хотя DAGMan позволяет выполнять SIPHT как единый процесс «запуск и завершение», некоторые из этапов протокола SIPHT требуют больших вычислительных ресурсов, и выполнение каждого из них может занять несколько часов для поиска одного репликона.Таким образом, для выполнения одного SIPHT-поиска всех 932 бактериальных репликонов потребовалось бы более двух месяцев, если бы он выполнялся на одном процессоре. Чтобы увеличить пропускную способность поиска SIPHT, в протокол SIPHT были включены распределенные вычисления с использованием Condor, распределенной пакетной системы, которая управляет распределением и выполнением вычислительных задач для распределенных систем, таких как вычислительные гриды [39]. Используя автоматизированное управление рабочим процессом и коллективную вычислительную мощность более 1500 вычислительных ядер в Grid Laboratory of Wisconsin (GLOW), SIPHT может выполнить поиск в типичном геноме за 1-2 часа и во всех 932 секвенированных бактериальных репликонах в базу данных NCBI менее чем за 12 часов без вмешательства пользователя. Каждый анализ в масштабах всего королевства требует более 1600 вычислительных часов (более 60 вычислительных дней), включает десятки тысяч отдельных файлов данных и требует выполнения 11 различных сценариев в общей сложности более 12000 раз, что, таким образом, было бы невозможно без высокой -пропускные возможности, используемые SIPHT.

Калибровка параметров поиска SIPHT

Протокол SIPHT включает в себя множество настраиваемых параметров поиска, включая максимальное значение E для согласований BLAST, минимальную оценку или пороги достоверности для предсказаний терминатора, а также минимальную и максимальную длину предсказанных локусов.Чтобы определить подходящие параметры поиска для наших поисков по всему королевству, мы провели 4 поиска SIPHT по 8 различным видам, повышая строгость каждого поиска путем согласованной настройки параметров, описанных выше (поиски A – D; см. Методы). Для этих анализов было выбрано 8 видов, в которых несколько межгенных локусов были подвергнуты экспериментальной проверке и / или были предварительно аннотированы на основе гомологии последовательностей с экспериментально подтвержденными межгенными транскриптами. У некоторых из этих видов значительное количество кандидатных локусов, которые были подвергнуты экспериментальному тестированию, не было подтверждено, что позволяет предположить, что они соответствуют ложным предсказаниям (именуемым повсюду ложными предсказаниями).

Как показано в, поиск с самой низкой строгостью (поиск A) дал более 70% из 212 подтвержденных транскриптов, но также 33% из 108 ложных предсказаний, что свидетельствует о том, что поиск с использованием этих параметров имеет высокую чувствительность, но низкую специфичность для реальных локусов, кодирующих мРНК. . Самый строгий поиск, поиск D, дал заметное снижение чувствительности для подтвержденных локусов (), особенно у V. cholerae и P. aeruginosa , где доля идентифицированных подтвержденных транскриптов снизилась с 60% до 10% и с 79% до 14% соответственно.Эти наблюдения показывают, что параметры, используемые в поиске A и поиске D, были недостаточно строгими и слишком строгими соответственно. Напротив, параметры поиска, используемые для поисков B и C, дали лишь небольшое снижение чувствительности по сравнению с поиском A, но значительно улучшили специфичность (). Параметры, используемые в поиске C, использовались в нашем поиске по всему королевству, потому что эти параметры дали более высокую специфичность, чем те, которые использовались в поиске B. Доля подтвержденных локусов, идентифицированных в поиске C, значительно варьируется среди 8 видов, включенных в этот поиск ().В целом чувствительность прогнозов SIPHT была заметно выше у протеобактерий, чем у других видов. Из известных непрогнозируемых мРНК большинство было пропущено, потому что связанный с ними терминатор не был идентифицирован. Это особенно верно для мРНК, пропущенных у видов Gm ⁺ .

Влияние вариаций параметров поиска на предсказания SIPHT.

Параметры поиска в поисках A – D становятся все более строгими и перечислены в разделе методов.

Таблица 1

Сравнение между локусами, предсказанными SIPHT, и локусами, ранее подвергавшимися экспериментальной проверке у 8 различных видов.

9049 E. coli K12

	Всего # экспериментально подтверждено a	% подтверждено предсказано SIPHT	Всего # проверено, но не обнаружено	% неподтверждено предсказано SIPHT
72	51.4	83	13,3
B. subtilis	4	50,0	0	–
V. cholerae	14	78,6	4	0,0
P._aeruginosa	20	60,0	11	9.1
S. aureus N315	8	12,5	0	–
С._мелилоти	15	66,7	0	–
S. typhimurium	66	72,7	10	40,0
Л.monocytogenes	13	30,8	0	–
Всего	212	59,0	108	14,8

Более 45000 локусов-кандидатов были идентифицированы в ходе поиска по SIPHT по всему королевству

Выходные файлы SIPHT для каждого из 932 бактериальных репликонов, включенных в наш поиск, инструкции по интерпретации данных в этих файлах и доступный в Интернете интерфейс к SIPHT доступен по адресу http: // bio. cs.wisc.edu/sRNA. Поиски SIPHT по всему королевству дали в общей сложности 47 273 локуса, включая 45 599 локусов, не соответствующих ранее протестированным мРНК или включенных в базу данных Rfam (v. 8.1) (далее именуемые локусами-кандидатами). Эта база данных содержит предполагаемые гомологи ранее подтвержденных межгенных локусов, идентифицированных с помощью эвристики на основе BLAST [4]. Эти кандидатные локусы были идентифицированы в хромосомах 461 из 524 штаммов, включенных в наш поиск, и в 260 из 364 плазмид. Многие из родов, в которых не было предсказано локусов, являются облигатными внутриклеточными симбионтами, такими как Mycoplasma sp.и Buchnera sp .; неясно, отражает ли отсутствие предсказанных локусов у этих видов отсутствие РНК-опосредованной регуляции или ограничения нашего алгоритма прогнозирования в идентификации регуляторных локусов РНК у этих организмов с уменьшенными геномами. В поисках SIPHT было предсказано в среднем 25 локусов на мегабазную пару хромосомной последовательности; однако плотность хромосомных локусов, предсказанная у разных видов, значительно варьировалась, в некоторых случаях даже между видами одного и того же рода (и таблица S1). Филогенетический анализ наших результатов показал, что виды с высокой плотностью предсказанных локусов, как правило, группируются среди близкородственных родов определенных типов, таких как γ- и β-протеобактерии и фирмикуты. В некоторых случаях вариация в плотности локусов может быть объяснена различиями в количестве предсказанных межгенных терминаторов и различиями в общем количестве межгенной консервации. Это было особенно верно для различий между видами одного и того же рода. Например, почти 50-кратная разница в количестве локусов, предсказанных среди видов Bacillus, почти полностью объясняется различиями в степени сохранения IGR (Таблица S1).Однако большая часть этих вариаций сохранялась даже после нормализации для сохранения IGR и плотности терминаторов. Эти данные позволяют предположить, что РНК-опосредованная регуляция может быть более распространенной у одних родов, чем у других.

Филограмма, показывающая вариации в плотности предсказанных локусов и в сохранности известных локусов и локусов-кандидатов среди различных родов бактерий.

Филограмма основана на последовательностях 16S РНК репрезентативных видов каждого рода. Роды Gm + и Gm− окрашены в синий и черный цвета соответственно.BLAST-анализы были выполнены для известных локусов и локусов-кандидатов из E. coli (Ec), V. cholerae (VcI для хромосомы I, VcII для хромосомы II) и B. subtilis (Bs), которые окрашены в красный цвет. , зеленый и синий соответственно. Закрашенные прямоугольники означают, что локус был предсказан на основе межгенной консервации в указанных родах. Столбцы, заштрихованные серым, и незатененные столбцы показывают результаты с BLAST E, установленным на 1 e-15 и 1e-3, соответственно.

Оценка точности прогнозов SIPHT

Хотя прогностический подход, используемый в наших поисках по всему королевству, доказал свою эффективность в идентификации генов, кодирующих мРНК, у различных видов, они часто приводили к значительной части ложных прогнозов [5], [ 7], [13], [18].Из-за объема нашего анализа использование экспериментальных методов для определения уровня ложных предсказаний для всех или даже для репрезентативной выборки видов невозможно. Чтобы оценить точность прогнозов SIPHT, мы оценили максимальное количество ложноположительных результатов для 8 видов, описанных выше, путем определения доли локусов, предсказанных в наших поисках, которые соответствуют экспериментально обнаруженным транскриптам или предполагаемым межгенным локусам, аннотированным в Rfam (). У большинства этих видов эта доля колеблется от 11% до 25%.Если предположить, что все регуляторные РНК, экспрессируемые этими видами, были ранее обнаружены и / или аннотированы в Rfam, эти результаты предполагают, что максимальная частота ложноположительных результатов среди этих видов составляет от 75% до 89%. Однако маловероятно, что база данных ранее обнаруженных регуляторных РНК и их гомологов представляет собой исчерпывающий каталог всех некодирующих транскриптов. Экспериментальный скрининг мРНК E. coli либо ограничивался большим количеством транскриптов, либо специфически нацеливался на транскрипты, которые взаимодействуют с шапероном РНК Hfq [40] — [43]. Кроме того, сотни межгенных локусов E. coli , предсказанных на компьютерных экранах, многие из которых идентифицированы двумя или более различными биоинформатическими алгоритмами, никогда не подвергались экспериментальной проверке [5], [10], [44]. Таким образом, даже у E. coli , вида, в котором на сегодняшний день были проведены наиболее обширные вычислительные и экспериментальные скрининги на мРНК, вероятно, что была идентифицирована только подмножество регуляторных РНК. Действительно, два недавних исследования показали, что E.coli экспрессирует в общей сложности 150–200 мРНК [10], [44].

Таблица 2

Доля локусов, предсказанных SIPHT, соответствующих ранее обнаруженным или аннотированным локусам, кодирующим РНК.

	HR включен a		HR исключен a
	# локусов, предсказанных SIPHT	% ранее обнаруженных или аннотированных 7	% ранее обнаруженных или аннотированных b
Э. кишечная палочка K12	401	11,0	308	13,8
B. subtilis	155	25,2	136	24,3
V. cholerae	78	43,6	42	57,1
P. aeruginosa	32	51.6	32	51,6
S. aureus N315	61	23,0	47	29,8
S. meliloti	218	6,4	186	7,5
S. typhimurium	410	12,3	355	13.9
L. monocytogenes	124	18,5	122	18,9
Всего	1479	15,9	1228	17,6

Как показано в, существует значительный диапазон соотношений подтвержденных локусов к общему количеству предсказанных локусов у разных видов. Это соотношение было больше 50% для В.cholerae и P. aeruginosa и менее 10% для S. meliloti . Высокое соотношение в V. cholerae отражает включение в этот анализ многих новых малых транскриптов, которые мы недавно идентифицировали в этом организме, используя беспристрастный подход высокопроизводительного секвенирования для открытия малых РНК (J. Liu, JL, MKW и A. Камилли, неопубликованные данные). Точно так же относительно низкое соотношение кандидатов к ранее идентифицированным локусам в S. meliloti , вероятно, отражает отсутствие всестороннего скрининга мРНК, проводимого в этом организме, а также относительно ограниченную гомологию между S.meliloti и виды, у которых было идентифицировано подавляющее большинство регуляторных РНК. Также возможно, что точность предсказаний SIPHT варьируется среди различных видов, возможно, из-за видозависимых различий в точности предсказаний терминатора или из-за различий в доступности подходящих партнеров BLAST для идентификации сохранения межгенных последовательностей. Как показано в, минимальная точность прогнозов SIPHT может быть улучшена за счет повышения строгости параметров поиска; однако, как обсуждалось выше, такая повышенная точность часто приводит к снижению чувствительности.

Не все предсказания SIPHT, которые соответствуют добросовестным межгенным транскриптам, будут соответствовать мРНК. Некоторые прогнозы могут соответствовать консервативным UTR мРНК или консервативным межгенным повторяющимся элементам; другие могут соответствовать цис-кодируемым регуляторным РНК, таким как рибопереключатели. Рибопереключатели представляют собой регуляторные элементы, кодируемые в нетранслируемых областях (UTR) мРНК, которые обычно модулируют экспрессию генов, переключаясь между конформациями терминации и антителами терминации в ответ на взаимодействия со специфическими метаболитами или, в случае Т-боксов, тРНК [45].Как описано ниже, SIPHT-аннотации предсказанных локусов могут использоваться для идентификации особенно сильных кандидатов на роль генов, кодирующих мРНК, для различения предполагаемых генов, кодирующих мРНК, и других типов межгенных локусов, а также для понимания потенциальных биологических ролей и / или или эволюция кандидатных регуляторных локусов, кодирующих РНК. Таким образом, помимо повышения строгости параметров поиска, фильтрация локусов-кандидатов с использованием этих аннотаций может значительно повысить точность прогнозов SIPHT (см. Ниже).

Идентификация сильных кандидатов в регуляторные РНК-кодирующие локусы

Как показано в, наши поиски дали 16 предполагаемых ложных предсказаний для нескольких видов. Мы предположили, что эти 16 локусов, вероятно, были идентифицированы с помощью SIPHT на основании ложных предсказаний терминатора и / или на основе гомологии первичной последовательности, которая не соответствует консервативным последовательностям или структурам РНК. Действительно, мы обнаружили, что если мы ограничим наши прогнозы локусами, которые связаны с терминаторами, предсказанными всеми тремя программами и предсказанными QRNA [12] для кодирования консервативной вторичной структуры (локусы ‘ZQ’), 23 из 125 (18%) экспериментально подтвержденные локусы, но ни один из 16 неподтвержденных локусов, выявленных в ходе наших первоначальных поисков, не был предсказан. Точно так же 28 (18%) из 152 подтвержденных локусов, но ни один из 35 неподтвержденных локусов, предсказанных в поиске A, не были локусами ZQ. Более того, среди всех локусов, предсказанных в ходе наших поисков по всему королевству, доля локусов ZQ была выше среди ранее аннотированных или подтвержденных межгенных локусов (23%) по сравнению с локусами-кандидатами (14%) (Таблица S1). Эти данные свидетельствуют о том, что ограничение прогнозов SIPHT локусами ZQ, заметно снижая их чувствительность, также значительно увеличивает их специфичность. Таким образом, 6561 кандидатный локус ZQ, предсказанный в нашем поиске, представляет собой особенно сильных кандидатов на реальные небольшие межгенные транскрипты.

Идентификация локусов, соответствующих UTR или последовательностям межгенных повторов

В предыдущих исследованиях многочисленные локусы, кодирующие межгенные мРНК, в конечном итоге показали, что они являются UTR мРНК с помощью Нозерн-анализа. Чтобы помочь идентифицировать предсказанные локусы, которые могут соответствовать консервативным UTR, а не генам, кодирующим мРНК, SIPHT аннотирует всех кандидатов, перекрывающих область до 30 п. н. выше ORF и / или связанных с терминатором в пределах 80 п.н. от его восходящей ORF как потенциальные 5. ‘И / или 3’ UTR соответственно.В общей сложности 8028 кандидатных локусов, предсказанных SIPHT, были аннотированы как потенциальные UTR (таблица S1), включая 4 (25%) из 16 предсказанных неподтвержденных локусов и 17 (14%) из 125 идентифицированных подтвержденных локусов. В то время как 3 из ранее подтвержденных транскриптов, аннотированных как локусы UTR ( E. coli sgrS и V. cholerae qrr1 и spot42 ), как было показано, функционируют как транс-действующие регуляторные транскрипты, предыдущие отчеты предполагали, что еще 4 ( E. coli и S.typhimurium sroC и sraF ) могут соответствовать цис-регуляторным РНК, а не мРНК [43], [46].

Аннотации SIPHT также показали, что почти 18% кандидатных локусов имеют гомологию с более чем 4 другими локусами, предсказанными в разных IGR, но в том же репликоне (локусы HR) (Таблица S1). Многие из этих локусов соответствуют ранее описанным последовательностям межгенных повторов в Burkholderia sp. [47] и к энтеробактериальным повторяющимся межгенным консенсусным последовательностям (ERICS) в E.coli , Yersinia sp. и Vibrio sp. [48] ​​- [50]. Предыдущие исследования показали, что ERICS функционируют как цис-действующие регуляторные элементы РНК [48], [50]. Из 226 локусов HR, ранее аннотированных в Rfam, почти все соответствуют подтвержденным или предполагаемым рибопереключателям. Только 3 из 125 подтвержденных транскриптов, идентифицированных в ходе наших поисков, были аннотированы как локусы HR, и функции этих небольших транскриптов еще предстоит определить [20], [40]. Поскольку многочисленные репликоны кодируют значительное количество локусов HR (таблица S1), фильтрация локусов HR может значительно уменьшить количество локусов-кандидатов у многих видов.Например, как показано в, исключение локусов HR в E. coli приводит к 26% ​​сокращению числа кандидатных локусов; в V. cholerae применение этого фильтра приводит к уменьшению числа кандидатных локусов на 59%. Интересно, что большинство локусов HR в V. cholerae были сконцентрированы в суперинтегроне хромосомы II. Исключение локусов HR увеличило долю ранее обнаруженных или аннотированных локусов, предсказанных в E. coli , S. aureus и V.cholerae , предполагая, что этот фильтр увеличивает специфичность предсказаний SIPHT для регуляторных генов, кодирующих РНК, у некоторых видов (). Однако исключение локусов HR не повысило специфичность прогнозов SIPHT у всех видов (). Поскольку количество HR-локусов значительно различается у разных видов (таблица S1), применение этого фильтра к выходным данным SIPHT может быть эффективным только для тех репликонов, в которых было предсказано значительное количество HR-кандидатных локусов.

Идентификация локусов, соответствующих предполагаемым рибопереключателям

Помимо идентификации большинства известных мРНК, SIPHT также идентифицировал 769 (31%) из 2447 рибопереключателей, ранее аннотированных в Rfam. Подавляющее большинство рибопереключателей, о которых сообщалось на сегодняшний день, было идентифицировано в 5′-UTRs у видов Gm ⁺ и большинство из них регулируют экспрессию биосинтетических ферментов или переносчиков метаболитов. В B. subtilis , организме, в котором рибопереключатели были широко изучены [51], SIPHT идентифицировал 29 (58%) из 50 рибопереключателей, аннотированных в базе данных Rfam, включая 27 (74%) из 34 известных или предполагаемых T -бокса, рибопереключатели SAM, TPP.

Недавние исследования показывают, что рибопереключатели регулируют экспрессию гораздо большего числа групп генов у более разнообразных видов бактерий, чем считалось ранее [22], [46].При изучении предсказанных локусов, соответствующих ранее аннотированным цис-кодируемым регуляторным РНК, мы обнаружили, что подавляющее большинство из них i ) кодируются на той же цепи, что и их 3′-ORF ii ), которые, по прогнозам QRNA, имеют консервативную вторичную структуру iii ), аннотированные как имеющие по крайней мере один другой гомолог в том же репликоне, и iv ) обнаруживаются менее чем на 100 п. о. выше стартового кодона связанного с ними гена. Таким образом, чтобы помочь идентифицировать локусы-кандидаты, соответствующие предполагаемым рибопереключателям, мы модифицировали протокол SIPHT, чтобы аннотировать предсказанные локусы как потенциальные рибопереключатели (локусы RS) на основе их ассоциации с этими 4 признаками, и повторили поиск по всему королевству.В результате наших поисков было предсказано 1978 кандидатных локусов RS. Кроме того, с помощью SIPHT было идентифицировано 439 локусов RS, соответствующих ранее аннотированным РНК, из которых 419 (95%) соответствуют подтвержденным или предполагаемым рибопереключателям. В их число вошли 22 (76%) из 29 подтвержденных или предполагаемых B. subtilis предсказанных рибопереключателей. Важно отметить, что только 1 из 125 ранее подтвержденных локусов, идентифицированных в нашем поиске ( гомолог S. typhimurium omrA ), был аннотирован как локусы RS. Взятые вместе, наши результаты предполагают, что аннотации RS могут быть надежно использованы для помощи в различении локусов, соответствующих мРНК, и локусов, соответствующих рибопереключателям.

Таким образом, всего 29 780 кандидатных локусов, предсказанных в ходе наших поисков, не были аннотированы как локусы RS, HR или UTR, что позволяет предположить, что они с большей вероятностью соответствуют генам, кодирующим мРНК, чем другим типам межгенных локусов. Из этих 29 780 локусов 3919 являются локусами ZQ и, таким образом, представляют собой особенно сильных кандидатов на новые гены, кодирующие мРНК.

Регулировка строгости BLAST дает более чувствительную аннотацию консервативности локуса и выявляет кандидатные локусы с необычными паттернами сохранения последовательности.

Каждый локус, предсказанный SIPHT, аннотируется с указанием числа и имен всех репликонов, в которых он, как было обнаружено, сохраняется в исходном состоянии. SIPHT BLAST поиск.Локусы, соответствующие домашним РНК, таким как тмРНК, RnpB и 4.5S РНК, были среди наиболее высококонсервативных, наряду с гомологами E. coli, Spot42 [52], RyhB [53] и GcvB [54]. Однако с параметрами BLAST, используемыми для поиска по всему королевству, степень сохранения нескольких ранее охарактеризованных мРНК, аннотированных SIPHT, была более ограниченной, чем ожидалось на основании предыдущих отчетов. Например, E. coli RyhB, который, как было показано, консервативен во многих родах Enterobacteriaceae , не сохранялся у Y.pestis и V. cholerae Spot42, который был идентифицирован на основе его гомологии с E. coli Spot42 сохранялся только среди других видов Vibrio (). Мы предположили, что это, вероятно, связано с относительно высокой строгостью BLAST, используемой в наших поисках по всему королевству. Действительно, когда поиски SIPHT были повторены со значением BLAST E, установленным на 1e-3, паттерны сохранения этих локусов согласовывались с ранее опубликованными результатами (). Эти данные предполагают, что, хотя высокая строгость BLAST дает более точные предсказания локусов, кодирующих мРНК, пониженная строгость BLAST может быть полезна для более чувствительной идентификации первичной консервативности последовательностей этих локусов у менее близкородственных видов.

Основываясь на результатах выше, мы повторили поиск SIPHT со значением BLAST E, установленным на 1e-3. Даже при такой пониженной строгости большинство идентифицированных подтвержденных мРНК и кандидатных локусов сохранялись только среди близкородственных видов. Однако, как показано в, SIPHT идентифицировал несколько кандидатных локусов, которые, как RyhB, Spot42 и GcvB [54], консервативны среди более разнообразных родов. Ни один из кандидатных локусов, показанных в значительной степени гомологии с ранее охарактеризованными РНК, предполагает, что они могут представлять новые классы хорошо законсервированных мРНК.

Аннотация гомологии первичной последовательности и консервативной синтении с известными регуляторными РНК дает представление о потенциальной функции и эволюции тысяч локусов-кандидатов

Было обнаружено, что в общей сложности 5359 предсказанных локусов имеют значительную гомологию с ранее предсказанными или подтвержденными мРНК или цис -кодированные регуляторные элементы, включая 3962 локуса, которые ранее не тестировались или не аннотировались в Rfam (Таблица S2). За исключением гомологов хорошо законсервированных РНК, таких как тмРНК, RnpB и Spot42, гомологи известных мРНК обычно обнаруживались только среди штаммов тех же родов или, в случае E.coli, в том же семействе. Таким образом, в соответствии с предыдущими открытиями [4], [5], мы обнаружили, что использование сохранения первичной последовательности для известных регуляторных РНК имеет ограниченную эффективность при расшифровке функции кандидатных локусов среди большинства разнообразных видов, включенных в наш анализ.

В большинстве случаев гомологичные мРНК, кодируемые близкородственными видами, разделяют консервативную синтению (т.е. фланкируются гомологичными ORF и кодируются в той же ориентации относительно этих ORF (см. Методы)).Интересно, что мы обнаружили 3562 локуса, которые имеют консервативную синтению, но не имеют значительной гомологии первичной последовательности с ранее аннотированными или подтвержденными локусами, кодирующими РНК (Таблица S3). К ним относятся кандидатные локусы у разных видов, кодируемые в том же геномном контексте, что и мРНК E. coli, Spot42, SgrS, SraA, SraG и tff, P. aeruginosa, RsmZ и B. subtilis SurC (и таблица S3 ). Было также обнаружено, что несколько ранее подтвержденных локусов имеют общую консервативную синтению, но не гомологию последовательностей с другими известными локусами.Например, было обнаружено, что SraG разделяет консервативную синтению с sRNA RliD, недавно подтвержденным в Listeria monocytogenes [55], и было обнаружено, что мРНК P15 P. aeruginosa [7] разделяет консервативную синтению с рибопереключателем TPP в L. monocytogenes , что позволяет предположить, что он может соответствовать рибопереключателю, а не транскодируемой мРНК. Кажется вероятным, что негомологичные локусы с консервативной синтенией произошли от общего предкового гена, но с тех пор разошлись на уровне своей первичной последовательности.Предыдущие исследования показали, что негомологичные мРНК, кодируемые разными видами, все еще могут выполнять аналогичные регуляторные роли и даже нацеливаться на гомологичные мРНК [15], [53], [56]; таким образом, возможно, что синтенозные локусы, кодирующие мРНК, по-прежнему разделяют консервативные регуляторные функции даже в отсутствие гомологии первичной последовательности. Следовательно, консервативный геномный контекст может быть использован вместо гомологии первичной последовательности при аннотировании предполагаемых локусов-кандидатов для их потенциальных биологических функций.Это особенно верно для 1138 локусов, которые разделяют консервативную 3′-синтению, но не имеют значительной гомологии с ранее идентифицированными цис-действующими регуляторными РНК (Таблица S3), поскольку функция этих элементов зависит от их геномного контекста.

Примеры консервативной синтении между кандидатными локусами и ранее идентифицированными мРНК.

Предсказанные локусы окрашены в черный цвет; указывается ранее аннотированное имя или номер кандидата для каждого локуса. Имена ORF основаны на аннотациях NCBI, а пунктирные линии соединяют гомологичные ORF (BLAST E <1e-3).Дополнительные кандидатные локусы с консервативной синтенией показаны в таблице S3.

Идентификация предсказанных локусов, связанных с предполагаемыми сайтами связывания факторов транскрипции

SIPHT идентифицировал 740 ранее подтвержденных или аннотированных локусов, связанных с предполагаемыми TFBS. В ходе нашего поиска был идентифицирован 21 из 22 альтернативных сайтов связывания сигма-фактора или фактора транскрипции, связанных с известными мРНК. Более того, из 22 предполагаемых σ ⁷⁰ -зависимых или SigA-зависимых промоторов, идентифицированных перед известными мРНК, подавляющее большинство находилось в пределах 10 п.н. от сайта начала транскрипции, как было определено экспериментально или как было предсказано на основании наблюдаемой длины мРНК и положение его предсказанного терминатора.В дополнение к идентификации известных sRNA-ассоциированных TFBS, SIPHT идентифицировал несколько ранее не аннотированных предполагаемых TFBS выше подтвержденных генов, кодирующих sRNA, которые могут дать ключ к разгадке функции этих не охарактеризованных sRNAs. Например, был обнаружен RpoE-зависимый промотор, связанный с мРНК RygC E. coli [57] и в том же относительном положении перед предполагаемыми гомологами RygC у нескольких других видов. Более того, предполагаемые σ ⁵⁴ сайта связывания были предсказаны перед P11 и P30 [7] в Pseudomonas sp. и sraJ / ryiA [11], [57] в нескольких штаммах Enterobacteriaceae .

Большинство кандидатных локусов, предсказанных в ходе наших поисков, не обладают значительной гомологией или консервативной синтенией с ранее охарактеризованными мРНК или рибопереключателями. Чтобы начать выяснение потенциальных ролей этих кандидатных локусов, мы проанализировали, связаны ли они с предполагаемыми сайтами связывания для σ ⁵⁴ , LexA и Fur. Эти факторы транскрипции хорошо законсервированы как у видов Gm-, так и у Gm +, и их регуляторные роли были определены у различных бактерий.Более того, было показано, что все три регулируют экспрессию ранее охарактеризованных мРНК.

σ ⁵⁴ — альтернативный сигма-фактор, который регулирует множество функций, включая подвижность и азотфиксацию. Недавно было показано, что σ ⁵⁴ контролирует экспрессию нескольких мРНК V. cholerae , участвующих в распознавании кворума [58]. Предполагаемые σ ⁵⁴ сайта связывания были связаны со 121 кандидатным локусом (Таблица S4), включая несколько ранее не аннотированных гомологов локусов Qrr [58] в Vibrio sp.

LexA — глобальный регулятор SOS-ответа. В E. coli было показано, что LexA ингибирует экспрессию мРНК IstR2 [59]. В общей сложности 113 кандидатных локусов, связанных с предполагаемыми блоками LexA, были идентифицированы как у грамотрицательных, так и у грамположительных видов (таблица S4), включая несколько кандидатных локусов, предсказанных у нескольких видов Enterobacteriaceae , которые имеют значительную гомологию с IstR2. Предположительно, многие из оставшихся кандидатов соответствуют локусам мРНК, регулируемым LexA, которые участвуют в SOS-ответе.

Fur модулирует экспрессию генов, участвующих в гомеостазе железа. У некоторых грамотрицательных видов Fur опосредует активацию множества генов посредством репрессии мРНК, которые негативно модулируют стабильность мРНК [15], [30], [53], [56], [60]. Наши поиски выявили в общей сложности 325 локусов, связанных с предполагаемыми сайтами связывания Fur (Таблица S4). Семьдесят четыре из них показали значительную гомологию с ранее охарактеризованными Fur-регулируемыми мРНК (FRS) в E. coli , V. cholerae , P.aeruginosa и N. meningitidis [15], [30], [53], [56], [60]. К ним относятся локусы, соответствующие всем ранее известным FRS (RyhB, NrrF и PrrF), почти все гомологи этих FRS в базе данных Rfam и 36 ранее неаннотированных локусов-кандидатов. Для всех ранее охарактеризованных FRS расположение предполагаемой коробки Меха относительно предсказанного терминатора соответствовало их экспериментально определенной длине. Поразительно, что для 73 из 74 локусов, имеющих общую гомологию с известными FRS, включая все локусы, соответствующие охарактеризованным FRS и ранее аннотированным гомологам FRS, предполагаемый сайт связывания Fur перекрывает предполагаемый промотор σ ⁷⁰ с предсказанным 3′-концом Fur бокса. расположен ровно на 1 нуклеотид ниже предсказанного 3′-конца предполагаемого промотора σ ⁷⁰ .Эти данные свидетельствуют о высококонсервативной организации операторов FRS. Дальнейший анализ выявил 26 дополнительных локусов, которые связаны с каноническим оператором FRS, описанным выше, но не имеют значительной гомологии с известными FRS. К ним относятся кандидатные локусы в Bacillus sp. которые представляют собой первые предполагаемые FRS, идентифицированные у видов Gm ⁺ . Они также включают первые предполагаемые FRS, идентифицированные у видов Haemophilus , Actinobacillus и Lactobacillus .

Выводы

Используя преимущества автоматизированных инструментов управления рабочим процессом и возможностей распределенных вычислений, SIPHT является первым вычислительным инструментом, который позволяет предсказывать и аннотировать локусы межгенного кодирования РНК в масштабах всего королевства. Предсказание межгенных локусов-кандидатов с помощью SIPHT в почти 800 репликонах в базе данных NCBI помогает заполнить значительные пробелы в текущих аннотациях бактериальных геномов. Более того, аннотация этих локусов для нескольких признаков дает ключ к разгадке потенциальных функций многих из этих предсказанных локусов и дает представление об эволюции нкРНК среди различных видов бактерий. SIPHT также представляет собой первый доступный в сети инструмент, с помощью которого исследователи, заинтересованные в изучении РНК-опосредованной регуляции, могут гибко проводить поиск межгенных локусов, кодирующих РНК, в интересующих их видах. Веб-интерфейс SIPHT позволяет изменять 19 различных параметров поиска, в том числе несколько, влияющих на строгость предсказаний терминатора и BLAST, и поэтому будет особенно ценным для тех исследователей, которые хотят настроить чувствительность или специфичность своего поиска.За счет значительного повышения пропускной способности и доступности предсказания нкРНК и обеспечения более полной аннотации как известных, так и предполагаемых регуляторных локусов, кодирующих РНК, SIPHT обеспечивает уникальный и важный ресурс для многих групп, изучающих РНК-опосредованную регуляцию у различных видов бактерий.

Хотя примеры РНК-опосредованной регуляции были обнаружены во всех сферах жизни, мы только сейчас начинаем осознавать важность и повсеместность этой регуляторной парадигмы. Обсуждаемые здесь прогнозы SIPHT порождают много вопросов, которые требуют будущих экспериментальных исследований.Во-первых, каково количество и вариабельность нкРНК в геноме? Мы идентифицировали кандидатные межгенные локусы в подавляющем большинстве бактериальных репликонов. Было предсказано, что большинство геномов размером 3–4 Мбп содержат ∼80–300 нкРНК-кандидатов, что соответствует примерно 3–10% от общего числа предсказанных ORF. Наши находки также указывают на то, что плотность ncRNAs варьирует у разных видов, но насколько значительно эти очевидные различия определяются межвидовыми вариациями в гомологии последовательностей и узнаваемыми Rho-независимыми терминаторами, неясно.Во-вторых, нацелены ли синтенные, но негомологичные мРНК (например, локусы, показанные и перечисленные в таблице S3) на гомологичные мРНК и / или регулируют ли аналогичные функции? Если это так, характеристика взаимодействий между этими неконсервативными, но функционально гомологичными мРНК и их родственными транскриптами-мишенями даст представление о совместной эволюции мРНК-мРНК и поможет выяснить последовательность и структурные ограничения, управляющие РНК-опосредованной регуляцией. Наконец, насколько широко распространена регуляция, опосредованная рибосвитчем, и насколько разнообразны процессы, которые контролируются этими цис-действующими элементами? Традиционно считалось, что рибопереключатели модулируют относительно небольшое количество путей, в основном те, которые участвуют в биосинтезе и транспорте, и значительно более распространены среди видов Gm +.Однако в соответствии с недавними выводами Weinberg et al. [22], наш анализ показывает, что рибопереключатели могут управлять более разнообразными процессами и более широко распространены среди Gm- организмов, чем считалось ранее.

Хотя многие тысячи новых нкРНК-кандидатов были идентифицированы с помощью SIPHT, многие истинных локусов, кодирующих мРНК, вероятно, были пропущены при этих поисках, потому что они перекрывают реальные или неправильно аннотированные ORF, плохо сохраняются и / или не связаны с предсказуемыми терминаторы транскрипции.Предположительно, эти локусы могут быть предсказаны с помощью алгоритмов, которые не полагаются на один или несколько из этих параметров. Модульный дизайн SIPHT позволит легко модифицировать его для включения новых программ и новых алгоритмов прогнозирования, предназначенных для обнаружения более неуловимых классов мРНК. Эта модульность также позволит добавлять новые программы и / или улучшенные версии существующих программ в SIPHT для повышения надежности его прогнозов и аннотаций. Скорость и легкость, с которой можно выполнять поиск с помощью SIPHT, позволит часто обновлять прогнозы и аннотации в масштабах всего королевства по мере появления новых данных.Таким образом, предсказания и аннотации SIPHT будут становиться все более эффективными по мере того, как станет доступно больше геномных последовательностей, по мере того, как будет подтверждено и охарактеризовано больше регуляторных РНК, и по мере определения новых консенсусных последовательностей TFBS. Помимо облегчения изучения нкРНК, SIPHT также служит справочной структурой для разработки нового поколения биоинформатических инструментов. По мере того, как базы данных геномных последовательностей продолжают расширяться быстрыми темпами, вычислительные подходы, такие как используемые SIPHT, которые эффективно интегрируют и эффективно выполняют множество новых и уже существующих биоинформатических инструментов, станут незаменимыми в наших попытках расшифровать сложные регуляторные сети, присущие системе биологические системы.

Казахстан обращается к странам ЕС за экономическим ростом

Казахстан стремится к партнерству со странами Европейского союза (ЕС), которые могут поддержать его экономику после пандемии COVID-19 и глобального экономического спада.

В пятницу премьер-министр Аскар Мамин провел онлайн-встречу, в которой приняли участие представители правительства Казахстана и главы дипломатических миссий стран ЕС, включая Германию, Нидерланды, Бельгию, Финляндию, Венгрию, Францию ​​и другие.

На встрече обсуждались способы преодоления новых вызовов, вызванных пандемией, и перспективы расширения сотрудничества между Казахстаном и ЕС.

Официальные лица в Нур-Султане рассматривают активный диалог между Казахстаном и ЕС как ключ к развитию торгово-экономического и инвестиционного сотрудничества. Агробизнес, производство, транспорт, энергетика, инфраструктура и строительство были определены в качестве приоритетных секторов, представляющих взаимный интерес, в которых могут быть установлены новые партнерские отношения. Кроме того, стороны договорились о дальнейшем сотрудничестве в таких сферах, как здравоохранение, зеленая экономика и изменение климата.

Отношения между Казахстаном и Европейским Союзом являются глубокими и отражены в документе, известном как Соглашения о расширенном партнерстве и сотрудничестве, который вступил в силу в марте этого года. Документ охватывает 29 сфер деятельности, включая торговлю, инвестиции, инновации и развитие инфраструктуры.

ЕС рассматривает крупнейшую экономику Центральной Азии как потенциальный рынок для экспорта тяжелой техники и транспортного оборудования, а также продукции обрабатывающей промышленности и химической промышленности.Со своей стороны, Казахстан поставлял в ЕС невозобновляемые энергоресурсы, поскольку в его экономике по-прежнему преобладают нефть и природный газ.

На долю ЕС в настоящее время приходится более половины прямых иностранных инвестиций в Казахстане, при этом с 2005 года было инвестировано более 150 миллиардов долларов. Кроме того, Европейский банк реконструкции и развития (ЕБРР) выделил почти 9,5 миллиардов долларов на 277 проектов, реализованных только в Казахстане. . Торговля между Казахстаном и ЕС составила более 15 долларов.5 миллиардов за последние восемь месяцев.

Между тем продолжающаяся пандемия серьезно повлияла на экономику страны, которая считается самой богатой в Центральной Азии.

В стране с населением почти 19 миллионов человек, в Казахстане с марта зарегистрировано более 110 684 случая заражения и 1796 смертей. Блокировка страны началась 16 марта и впоследствии несколько раз продлевалась. Жесткие ограничения, введенные правительством для сдерживания вспышки коронавируса, остановили большую часть экономической деятельности в Казахстане, в результате чего многие люди потеряли работу.

Валовой внутренний продукт Казахстана снизился на 3 процента за последние восемь месяцев, по данным министерства национальной экономики страны. Объем производства в секторе услуг упал на 6,1 процента после того, как правительство распорядилось закрыть большинство общественных мест, включая салоны красоты, парикмахерские, тренажерные залы и фитнес-клубы, крытые продовольственные и непродовольственные рынки, кинотеатры и пляжи. Согласно опросу, проведенному Национальной палатой предпринимателей страны, ограничения, введенные властями, затронули 800 000 или более 60 процентов малых и средних предприятий в Казахстане.Около 30 процентов респондентов заявили, что они готовы сократить и оптимизировать свой штат, что означает, что половина сотрудников будет уволена, а другая половина будет вынуждена уйти в неоплачиваемый отпуск.

Между тем, другие отрасли — такие как строительство, сельское хозяйство, обрабатывающая промышленность и промышленное производство — показали незначительный рост.

Правительство Казахстана работает над смягчением последствий экономических последствий. Утвержденный еще в 2018 году Стратегический план развития Казахстана теперь рассматривается как инструмент для обеспечения дальнейшего развития экономики после пандемии коронавируса и мирового финансового кризиса.Инициатива предусматривает меры по созданию экспортно-ориентированных производств с высокой добавленной стоимостью в обрабатывающей промышленности и сельском хозяйстве. Кроме того, в документе говорится о том, как ускорить цифровизацию, укрепить систему здравоохранения, повысить качество и доступность инфраструктуры до 2025 года.

«Если говорить о роли правительства, то, конечно, Казахстан много сделал», — сказал «Интерфаксу Казахстан» региональный экономист Европейского банка реконструкции и развития (ЕБРР).

«Объем фискальных мер в денежном выражении превышает 8% ВВП. Если посмотреть все страны, в которых работает ЕБРР, Казахстан находится на одной из лидирующих позиций [по этому показателю], и только страны ЕС опережают его. К тому же долг страны к ВВП невелик », — добавил он.

Согласно отчету, опубликованному ЕБРР в начале сентября, ожидается, что реальный ВВП Казахстана сократится на 4 процента в 2020 году, а затем вырастет на 3 процента в 2021 году, «за счет восстановления частного потребления и повышения цен на нефть.”

.